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小鼠脾脏CD3+T淋巴细胞分离、培养及鉴定教程

时间:2024-04-29 09:15:00 点击:281次

小鼠脾脏CD3+T淋巴细胞分离、培养及鉴定教程

一:细胞介绍

T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞,来源于骨髓的淋巴干细胞,在胸腺中分化、发育成熟后通过淋巴和血液循环分布全身免疫器官和组织中发挥免疫功能,根据其表面特异性的CD分子主要分为三种:CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD3+T细胞表面含有一种特异性的CD3多聚体蛋白复合物它由四个不同的多肽链组成:epsilon (ε)、gamma (γ)、delta (δ)和zeta (ζ),他们组装并作为三对二聚体(εγ、εδ、ζζ)发挥作用,CD3复合物作为T细胞共受体,与T细胞受体(TCR)非共价结合、形成TCR-CD3复合体,参与T细胞的信号转导共同参与T细胞的抗原的识别。

二:实验准备

提前准备好将要用到的试剂:小鼠脾脏CD3+T细胞专用培养基、PBS清洗液、红细胞裂解液、分选buffer、Biotin-Antibody mix、Strsptavidin Beads。

三:实验步骤

制备单细胞悬液,从小鼠身上取出需要的脾脏器官在70 μm细胞筛网上研磨脾脏,以预冷的PBS冲洗细胞筛网收集细胞悬液于50 mL离心管中,放入离心机中进行离心,500g,离心5min离心结束,弃上清,加入5 mL红细胞裂解液(ACK)室温裂解5min,再加入20 mL PBS,500g,离心5min。注意红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间,少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度,离心完成后,弃上清,将脾细胞重悬于PBS细胞悬液用70 μm细胞筛网进行过滤提取细胞溶液进行计数,计数完成后,500g,离心5min离心完成后,弃上清将细胞重悬于分选buffer中

调整密度为1×108cells/mL将100 μL细胞悬液加入无菌流式管底部再加入2 μL Biotin-Antibody Mix混匀后4℃孵育10min孵育完成后在流式管中加入20 μL Streptavidin beads轻轻吹打混匀混匀后4℃孵育10min孵育完成后在流式管中加入1 mL分选buffer,用移液器上下混合吹打5次混匀(避免剧烈震荡或上下颠倒混匀),将含有细胞的分选流式管置于磁力架上静置5min将细胞悬液小心吸出,转移至一个无菌离心管中吸出过程注意不要碰到管壁磁珠此细胞悬液中即包含纯化的小鼠CD3+T细胞500g,离心5min离心后弃上清,收集细胞将细胞接种于专用培养基中,转移至T25细胞培养瓶中十字摇晃混匀置于培养箱中进行培养。

细胞鉴定

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