产品描述
本产品为hPSC诱导分化心肌细胞试剂盒，分化获得的心肌细胞具有搏动能力，能表达特异性标志物(如 Cardiac Troponin T 等)，适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对心肌细胞具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供6个孔的hPSC(约3×106 个细胞)诱导分化。
本产品分化流程图
hPSC：人多能干细胞;CM：心肌细胞
产品信息
表1. 试剂盒组成信息
注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)和补充剂B (25×)需添加进基础培养基使其分别稀释50倍以及25倍，使得补充剂终浓度为1×，配成心肌诱导培养基1。
实验试剂与材料
表2. 推荐试剂&材料
实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)
一、试剂准备
表3. 各阶段培养基成分
(1) 在 4℃解冻补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如心肌诱导培养基1组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂B，若用量为12 mL，配制方法为11.28 mL基础培养基+240μL补充剂A(50×)+480μL补充剂B(25×)。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：所有补充剂以及心肌细胞消化液可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)
(http://www.immocell.com/xiazai/hESC(H1)%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf操作说明书)
(http://www.immocell.com/xbpyvideo/4240.html操作视频教程)
三、DAY 0-2: hESC向中胚层诱导
(1) DAY -1： 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。
(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞悬液收集到15mL离心管中，室温下200 g离心5 min。
(4) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(5) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，按2.5 × 105个细胞/mL，接种于低吸附6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。
(6) DAY 0：24 h后，在镜下观察，细胞球直接应在50μm-100μm左右。100g离心3min，吸去培养基，加入2mL心肌诱导培养基1(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂B)重悬，转移至原孔内。
(7) DAY 1：使用心肌诱导培养基2(成分为：基础培养基，1×补充剂A)，按步骤(6)操作换液，继续培养24 h。
注：细胞球直径尽量控制在50μm-100μm附近，若过大，在分化后期将导致细胞球死亡解聚。换液时尽量不要过多吹打细胞球，除低速离心外，还可将细胞球吸至15mL离心管，待其自然沉降，弃上清换液。除了用低吸附板外，还可使用经过防止细胞贴壁的特殊液体润洗的板进行培养。
四、DAY 2-7: 中胚层向心肌中胚层诱导
(1) DAY 2： 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌诱导培养基3(成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂C)，于培养箱培养48 h。
(2) DAY 4：将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌诱导培养基2(成分为：基础培养基，1×补充剂A)，隔天换液，直到DAY 7 。
注：除步骤中换液方式外，还可将细胞球吸至15mL离心管，待其自然沉降，弃上清换液，换液时尽量不要吹打细胞球。
五、DAY 7-15: 心肌中胚层向心肌细胞诱导
(1) DAY 7: 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌成熟培养基(成分为：基础培养基，1×补充剂D)，隔天换液，直到DAY 15 。
(2) DAY 15: 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌细胞消化液，于培养箱中孵育3-4 h。待单个细胞颗粒明显时，随后使用同等体积的心肌成熟培养基(含10μM Y-27632)中止消化，吹散。
(3) 200 g离心弃去上清，可加入心肌成熟培养基重悬接种于Matrigel上进行维持培养，或加入冻存液进行冻存。
注：1、在第8天至第15天之间，可观察到搏动的细胞。
2、消化时可将六孔的细胞球收集至2孔或3孔进行消化。冻存液可以使用90%FBS+10%DMSO或心肌细胞冻存液(逸漠生物，IMC-705)进行冻存。
3、若进行2D维持培养，消化时可使用心肌细胞消化液消化1-2 h。
4、进行2D培养时，若杂细胞较多，可加入心肌纯化培养基进行纯化。观察纯化情况，最长可纯化4天，期间换一次液。
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