产品描述
本产品为人多能干细胞向神经干/祖细胞(iNSPC)诱导分化试剂盒，分化获得的NSPC能表达神经干细胞或前体细胞的特异性标志物(如SOX2、SOX1、Nestin 等)，适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对多能干细胞2D诱导分化以及神经球培养具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供16孔的hPSC诱导分化。
本产品分化流程图
产品信息
表1. 试剂盒组成信息
注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(50×)和补充剂B (100×)需添加进NSPC诱导基础培养基使其分别稀释50倍以及100倍，使得补充剂终浓度为1×，配成NSPC诱导培养基。NSPC诱导包被液浓度500 U/mL表示每毫升有500个单位的包被蛋白。
实验试剂与材料
表2. 推荐试剂&材料
实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)
一、试剂准备
表3. 各阶段培养基成分
(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如NSPC诱导培养基组成为NSPC诱导基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂B，若用量为50 mL，配制方法为48.5mL NSPC诱导基础培养基+1 mL补充剂A(50×)+500μL补充剂C(100×)。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)
(http://www.immocell.com/xiazai/hESC(H1)%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf操作说明书)
(http://www.immocell.com/xbpyvideo/4240.html操作视频教程)
三、DAY 0-6: hESC分化为神经干/祖细胞(NSPC)
(1) NSPC诱导包被液在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合，稀释成合适的浓度，按2 U/cm2的包被密度铺板，备用。
(2) DAY 0：当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。
(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5) 从步骤(1)包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。
(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的NSPC诱导培养基(成分为：NSPC诱导基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂B)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤1制备的包被板上使得最终密度为6.0 -8.0× 104个细胞/cm2，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(8) DAY 2：48h后吸去培养基，并加入不含2mL Y-27632的NSPC诱导培养基，隔天换液直到第7天。
(9) 可取第7天的细胞进行免疫荧光染色检测NSPC标志物如SOX2、SOX1、Nestin。
注：包被液使用时需在冰上操作，所有与包被液直接接触的物品需提前预冷。
四、NSPC维持培养阶段
(1) DAY 7：第7天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。
(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3) 3-5min后，将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(4) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的NSPC扩增培养基(成分为：NSPC扩增基础培养基，1×补充剂C)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(5) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，使用NSPC扩增培养基稀释细胞，将细胞以5×105/mL接种到低吸附六孔板中，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(6) 24h后，100g离心弃去上清，换成不含Y-27632的NSPC扩增培养基，视培养基颜色或隔2天半量换液。
(7) 当NSPC长成100-150μm直径的神经球时，建议进行传代。
注：①当形成肉眼可见的神经球时，可将神经球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到神经球的情况下尽量将培养基吸尽，进行换液，尽量避免离心。②NSPC可使用逸漠生物神经细胞无血清冻存液在液氮中冷冻。
五、NSPC传代
(1) 将神经球摇晃至中心，吸取中间神经球于15mL离心管，100g 离心5 min。
(2) 弃去上清后加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将离心管置于37℃水浴消化10-15 min。
(3) 10-15 min后每孔加入1mL NSPC扩增培养基(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞解离成小团块或单细胞。
(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的NSPC扩增培养基重悬细胞，轻轻地上下移液以确保细胞溶液均匀。
(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，使用NSPC扩增培养基稀释细胞，将细胞以5×105/mL接种到低吸附六孔板中。
注：仅分化结束收获细胞时第一天必须添加10 μM Y-27632，后续传代第一天不需要添加10 μM Y-27632。
