hPSC来源运动神经元祖细胞iMNP-H1试剂盒使用说明书下载
产品描述
本产品为hPSC来源运动神经元祖细胞iMNP-H1试剂盒,分化获得的MNP能表达特异性标志物(如 Olig2 等),适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验,对细胞培养具有一定了解。
以六孔板为例,本产品提供的规格可供两个孔的hPSC诱导分化,最终可获得6个孔的运动神经元祖细胞(约1.2×107个细胞),以及可供运动神经元祖细胞扩增至少一代(六孔板1孔传6孔)。
本产品分化流程图
hPSC:人多能干细胞;NPC:神经祖细胞;MNP:运动神经元前体细胞。
产品信息
注:括号内容如100×为母液浓度,使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(100×)和补充剂C (62.5×)需添加进基础培养基使其分别稀释100倍以及62.5倍,使得补充剂终浓度为1×,配成NPC诱导培养基。
实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)
一、试剂准备
(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D,不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中,参考表1及表 3,按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如NPC诱导培养基组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂C,若用量为20mL,配制方法为19480μL基础培养基+200μL补充剂A(100×)+320μL补充剂C(62.5×)。
(3) 分化培养基建议现配现用,置于 4℃储存,2 周内使用。
注:补充剂B、D使用时尽量避光,且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)
三、DAY 0-6: hESC分化为神经祖细胞(NPC)
(1)基质胶在4℃下解冻,与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100),铺板,备用。
(2)DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%,吸去培养基,用2mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC,吸去PBS。
(3)加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase,转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min,使其解离成单细胞。
(4)3-5min后,将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中,并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞,制成单细胞悬液,将细胞单悬液收集到15mL离心管中,室温下300 g离心5 min。
(5)从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(6)离心结束,充分去除上清,将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞,轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(7)使用自动细胞计数器计数细胞,使用台盼蓝排除死亡细胞,将细胞接种到步骤1制备的6孔基质胶包被的板上使得最终密度为3.0 × 104个细胞/cm2,在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632),将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(8)DAY 0: 24h后吸去培养基,并加入2mL NPC诱导培养基(成分为:基础培养基,1×补充剂A,1×补充剂C)。
(9)隔天使用NPC诱导培养基换液,直到第6天。
(10)可取第6天的细胞进行免疫荧光染色检测NPC标志物如SOX2、SOX1、Nestin。
注:基质胶使用时需在冰上操作,所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷,基质胶超过10℃将迅速凝固,导致铺板失败。
四、DAY 6-12: NPC诱导分化为运动神经元祖细胞(MNP)
(1)DAY 6: 第6天,从培养物中抽吸培养基,在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物,然后从孔中移除PBS。
(2)加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase,转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min,使其解离成单细胞。
(3)3-5min后,将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中,并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞,制成单细胞悬液,将细胞单悬液收集到15mL离心管中,室温下300 g离心5 min。
(4)从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(5)离心结束,充分去除上清,将6 mL预热的MNP诱导培养基(成分为:基础培养基,1×补充剂B,1×补充剂C)(含10μM Y-27632)重悬细胞,轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按1:3比例接种在基质胶包被的板中,每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
(6)DAY 7: 第7天开始隔天更换一次MNP诱导培养基,直到第12天。
(7)可取第12天的细胞进行免疫荧光染色检测MNP标志物Olig2。
注:MNP可用常规冷冻培养基(DMEM/F12、10%胎牛血清和10% DMSO)或逸漠生物无血清细胞冻存液(推荐使用)在液氮中冷冻,解冻后可在MNP扩增培养基中再次培养,培养方法见补充部分。
五、DAY 12: MNP扩增
第12天获得的MNP可扩增至少5代,5代内可维持Olig2高表达。
扩增方法如下:
(1)DAY 12: 第12天,从培养物中抽吸培养基,在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物,吸去PBS。
(2)每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase,将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。
(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632),轻轻吹打细胞,使细胞脱离孔底。
(4)将细胞悬液收集到15 mL离心管中,室温下300 g离心5 min。
(5)仔细抽吸上清液,不干扰细胞,用1mL恢复室温的MNP扩增培养基(成分为:基础培养基,1×补充剂C,1×补充剂D)(含10μM Y-27632)重悬细胞,轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6)按1:6比例接种在基质胶包被的板中,每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
(7)第2天更换不含Y-27632的MNP扩增培养基。每周可传一次代。