hPSC来源运动神经元祖细胞iMNP-H1试剂盒使用说明书下载
产品描述
本产品为hPSC来源运动神经元祖细胞iMNP-H1试剂盒，分化获得的MNP能表达特异性标志物（如 Olig2 等），适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对细胞培养具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供两个孔的hPSC诱导分化，最终可获得6个孔的运动神经元祖细胞（约1.2×107个细胞），以及可供运动神经元祖细胞扩增至少一代（六孔板1孔传6孔）。
本产品分化流程图
hPSC：人多能干细胞；NPC：神经祖细胞；MNP：运动神经元前体细胞。
产品信息
注：括号内容如100×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A（100×）和补充剂C (62.5×)需添加进基础培养基使其分别稀释100倍以及62.5倍，使得补充剂终浓度为1×，配成NPC诱导培养基。
实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)
一、试剂准备
(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如NPC诱导培养基组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂C，若用量为20mL，配制方法为19480μL基础培养基+200μL补充剂A（100×）+320μL补充剂C（62.5×）。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：补充剂B、D使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)
三、DAY 0-6: hESC分化为神经祖细胞(NPC)
(1)基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合（基质胶:DMEM/F12=1:100），铺板，备用。
(2)DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。
(3)加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(4)3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5)从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(6)离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(7)使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤1制备的6孔基质胶包被的板上使得最终密度为3.0 × 104个细胞/cm2，在6孔板中每孔最终体积为2 mL（含10μM Y-27632），将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(8)DAY 0: 24h后吸去培养基，并加入2mL NPC诱导培养基（成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂C）。
(9)隔天使用NPC诱导培养基换液，直到第6天。
(10)可取第6天的细胞进行免疫荧光染色检测NPC标志物如SOX2、SOX1、Nestin。
注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。
四、DAY 6-12: NPC诱导分化为运动神经元祖细胞(MNP)
(1)DAY 6： 第6天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。
(2)加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3)3-5min后，将DMEM/F12（含10μM Y-27632）以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(4)从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(5)离心结束，充分去除上清，将6 mL预热的MNP诱导培养基（成分为：基础培养基，1×补充剂B，1×补充剂C）（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按1:3比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
(6)DAY 7: 第7天开始隔天更换一次MNP诱导培养基，直到第12天。
(7)可取第12天的细胞进行免疫荧光染色检测MNP标志物Olig2。
注：MNP可用常规冷冻培养基(DMEM/F12、10%胎牛血清和10% DMSO)或逸漠生物无血清细胞冻存液(推荐使用)在液氮中冷冻，解冻后可在MNP扩增培养基中再次培养，培养方法见补充部分。
五、DAY 12: MNP扩增
第12天获得的MNP可扩增至少5代，5代内可维持Olig2高表达。
扩增方法如下：
（1）DAY 12: 第12天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。
（2）每孔加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。
（3） 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12（含10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
（4）将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（5）仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的MNP扩增培养基（成分为：基础培养基，1×补充剂C，1×补充剂D）（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（6）按1:6比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
（7）第2天更换不含Y-27632的MNP扩增培养基。每周可传一次代。
