细胞培养技术在生物研究领域内是必不可少的核心环节,在培养过程中面临的一个严重问题就是细胞污染，一般来说，细胞污染不可避免，但是可以减少其发生的频率和后果严重性，所以一定要注意细胞培养过程中环境。那么细胞培养过程中我们可能遇到哪些污染?通过什么样的方法检测细胞污染种类?
细胞污染根据污染源主要可以分为化学性，物理性和生物性污染。
化学性污染
培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。
细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。
玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。
动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。
细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。
物理性污染
物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温 度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。
细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。
培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。
微生物污染
由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时，能及时处理并除去污染物，部分细胞还有可能得到挽救。
不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。
常见细胞污染种类有：细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、病毒污染、细胞交叉污染等。
细菌污染
细菌污染较常见的有大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现，多数情况下培养液短时间内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象;有时静置的培养液起初不混，但稍加震荡，就有许多混浊物漂起。
细菌、真菌污染的检测
肉眼观察：细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。
接种观察：采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
显微镜下观察：在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染;若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
杆菌污染检测
显微镜下观察：在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量杆状游动的小虫子，前期培养液不浑浊，对各种抗生素无效，难以清除，换掖冲洗后也无效。
测序验证：取适量培养液提基因组送测序，然后分析测序结果判断为杆菌污染。
处理方法：一般用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48小时后再换常规培养液，有时在早期污染时此法有效。细胞培养中用抗生素多为预防细菌污染，一半多联合应用。一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除，有的抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应。
霉菌污染
种类很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。
霉菌污染检测
倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。
处理：确认是霉菌污染，如果细胞种类不是特别珍贵，直接放弃，并将实验环节彻底消毒。
支原体污染
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。
支原体污染的检测
a.显微镜观察
直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈黑色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等区别开来。
b.PCR检测(MycoTest™ Kit)
利用降落聚合酶链式反应技术(TD-PCR)对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。如果有支原体污染即可在400～600bp左右能看到一条很亮的条带。
该方法优点：快速，特异性强适用于一般实验室支原体检测预防。
c. ERA检测
用酶促重组等温扩增技术(ERA技术)和单分子荧光检验技术(SM@RT)，在恒定温度(37℃)下可对特异基因进行扩增及定性检测，通过实时荧光扩增曲线，在20分钟内即可判断样品中是否含特异基因，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。
d.荧光染色法观察
用荧光染料与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体成绿色小点，散于细胞周围或附于细胞表面。
e.电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或投射电镜观察。一般在细胞培养48-72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。
f.培养检测
将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养基有无雾状沉淀，然后取0.5mL加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
处理：市场上有多种支原体清除试剂盒，效果比较好。
黑胶虫污染
黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
黑胶虫污染的检测
a.显微镜观察
在显微镜的高倍镜下可见培养液中有小黑点状颗粒，并在原点做布朗运动或震动，即为大致判断为黑胶虫污染。黑胶虫比细胞体积小很多，主要分布在细胞间隙。
黑胶虫污染前期细胞无明显变化，培养液中有少许做布朗运动的小黑点，污染后期小黑点会迅速增殖导致细胞出现裂解死亡。细胞勤换液可以稍微缓解黑胶虫增殖速度，但无法摆脱污染。
b.PCR检测
利用聚合酶链式反应技术(PCR)对黑胶虫基因组进行特异性扩增检测。
c.ERA检测
用酶促重组等温扩增技术(ERA技术)对齐基因组进行特异性等温扩增检测
病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
病毒的检测
a.应用电镜技术快速诊断动物病毒病。
b.逆转录-聚合酶链式反应RT-PCR检测病毒。
c.酶促重组等温扩增检测病毒。
细胞交叉污染
细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。
虽然细胞培养过程中不可避免会产生细胞污染，但是建立良好规范操作如有计划放置培养箱，尽量减少开门时间和不必要的移动;尽快清除溢出物，之后用酒精清洁等还是可以减少细胞污染频率，在细胞培养过程中，经常性地检查是否被污染，如果污染及时处理减少损失。
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