活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。
目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。
什么是LUC
荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
什么是GFP
绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。常用于细胞标记后移植追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
什么是RFP
红色荧光蛋白，目前使用的是 mCherry一种来自于蘑菇珊瑚（mushroom coral）的红色荧光蛋白，常有于标记和示踪某些分子和细胞组分。相对于其他荧光，mCherry的好处在于它的颜色和应用最多的绿色荧光蛋白（GFP）能进行共同标记，并且mCherry相对于其他单体荧光蛋白来说也具有卓越的光稳定型。本产品将红色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。常用于细胞标记后移植追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
小动物活体成像技术原理
1. 标记原理
哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
1.1.生物发光成像系统组成
体内可见光成像系统主要由三局部组成
[1] CCD镜头：选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。
[2] 成像暗箱：像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源,可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，防止外界环境的光污染。
[3]软件系统：软件系统负责仪器控制和图像分析。
1.2.标记细胞的方法
通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。
1.3结果观察
将标记好的细胞注入小鼠体内后,观测前需要注射荧光素酶的底物一荧光素,为约280道尔顿的小分子。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件。
2. 光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。
2.1. 实验过程
通过分子生物学克隆技术, 应用单克隆细胞技术的筛选，将荧光素酶的基因稳定整合到预期观察的细胞的染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶蛋白的细胞株。
2.2.荧光成像功能
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白DsRed 及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似。荧光成像具有费用低廉和操作简单等优点。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性要好得多，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。
虽然荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。虽然许多公司采用不同的技术分离背景光，但是受到荧光特性的限制，很难完全消除背景噪音。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。但是，荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和观察小分子体内代谢方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法。最近许多文献报道的实验中，利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用成熟的荧光成像技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究；然后利用生物发光技术进行动物体内检测，进行活体动物体内研究。
小动物活体成像常见问题及分析
1.荧光素酶的发光是否需要激发光？
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素（Luciferin）。
2.在体外的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选?
体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长， 接种代数不要很多。到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度，厦门逸漠生物的LUC 、GFP 、RFP及双标记使用puro、bsd抗性筛选。
3.底物荧光素（Luciferin）是如何进入小鼠体内的?需要多少?
荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg 。20克的小鼠约需3mg的荧光素。
4.荧光素酶的发光特性如何?
通过腹腔注射老鼠后约一分钟左右荧光素酶就开始发光，通常十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点通常持续约20-30分钟后开始衰减，约三小时后发光全部消失。通常最好的检测时间是在注射后15 - 35分钟之间，但建议实验人员在做不同实验模型前进行连续时间点发光曲线的绘制，以确定最高稳值的时间范围。
5. 如何保证荧光素酶（Luciferase）的稳定性?
荧光素酶基因是插到细胞染色体上的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。
6. 标记的肿瘤接种以后，会发生 Luciferase 的丢失吗?
丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。有一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明 Luciferase 基因的标记非常稳定。
7. 可以用肿瘤块而不是细胞接种吗?
可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。
8. 标记细胞与标记基因所用的启动子有何不同?
标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子, 显示细胞的数目。标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达, 显示此基因的表达数目，厦门逸漠使用的启动子是CMV。
9. 荧光素酶的表达高低与所用启动子的活性有关吗?
有关，启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。
10. 有几种常用的荧光素酶?特性如何?
常用的荧光素酶有两种，分别是Luciferase 和 Renilla 荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在 540-600nm，后者所发的光波长在 460-540nm 左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。大部分的发表文章通常使用前者用作报告基因， 也有一些文章使用两者进行双标记。
11. 组织切片可以观察到生物发光吗?
可以，但荧光酶的体外活性保持时间比较短， 约几十分钟。有相关的文献。
12.正常成体小鼠可以看到体内发光吗?是否不需要裸鼠?
可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同,可以看到成体正常老鼠的体内发光。这正是这项技术的价值所在。可见光的穿透能力在3-4cm, 所以大鼠也可以作为活体成像的动物，并有很多关于大 鼠的文章。
13.荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比?
是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点，包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。密西根大学Brian Ross发表的一篇文章专门研究了这个问题。确定荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9 以上。
14.荧光素酶发光的波长与体内的穿透性如何关系?
荧光素酶发出的光主要是偏红光,与绿色荧光蛋白（GFP）的绿色荧光不同。荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍 。因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素,其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。
15.为什么建议尽量用RFP而不是GFP来检测体内发光?
红光比绿光在体内的穿透性要强近一百倍。波长越长的荧光越容易透过组织，
在条件允许的情况下，我们建议选择波长较长的荧光染料。
影响成像效果三个因素
主要需要考虑以下影响因素：底物给药方式、荧光标记物波长和动物毛发。
1.底物给药方式
常用的底物给药方式有腹腔注射和尾静脉注射。
腹腔注射：迅速分布全身，并穿过包括大脑在内的血液组织屏障;注射底物 10～20 分钟后，发光信号达到峰值;60 分钟内逐渐减少，直到不可检测。
尾静脉注射：可提供更好的再现性和 5～10 倍的高信号，但是注射难度较高，代谢快。
建议：第一次使用荧光素酶底物成像，或者更换新品牌底物，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值。确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于所有实验，以标准化成像数据。
2.荧光标记物波长
大多数生物体内都表现出一种天然的荧光，通常被称为「自发荧光」。这些荧光与标记物发射波长重叠，经激发光照射会发射出与标记物相似的荧光波长，导致低信噪比，检测灵敏度受限，甚至无法检测。譬如，GFP 的最大激发波长是 488 nm，最大发射波长是 507 nm。
这和皮肤及毛发中的胶原蛋白和弹性蛋白等成分的发射波长相近，有较高的背景信号。此外，标记物激发波长越短，散射越强，吸收越大，穿透深度越浅，越不利于体内深层部位的信号检测。
建议：使用近红外波长的荧光染料，优点是更高信噪比，穿透更深，或使用 iRFP 作为报告基因，该荧光蛋白具有更高的亮度、光稳定性和信噪比。
3.动物毛发
C57BL/6 小鼠毛发生长周期由三个阶段组成：静止期（皮肤为淡粉色）、生长期（皮肤变为深灰色或黑色）、成熟期（毛发停止生长，皮肤恢复为淡粉色）。
生长期中的皮肤色素沉着是活体成像中的一个重要变量，特别是当需要对小信号变化或动物之间的差异敏感时。强烈着色的皮肤可导致 90% 以上的光信号衰减，这显然会导致显著的实验误差。此外，就算是处于静止期或成熟期的小鼠，身上的毛发也会造成一个数量级的光信号衰减。
建议：成像前一天，需要通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。
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