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逸漠细胞学堂

第三节：小鼠下丘脑神经干细胞分离、培养、鉴定教程

时间：2023-05-12 15:03:05 点击：2376次

细胞简介

神经干细胞分离自脑皮层组织;大脑分左右两个半球，大脑皮质(灰质)覆盖着每个大脑半球的大部分，它是神经元胞体集中的地方。内部则是由神经纤维或髓鞘构成的白质。每一个半球都有三个面，即外侧面(约占整个皮质面积的1/3)、内侧面和底面(占2/3的面积);半球表面有很多深浅不等的沟或裂，沟或裂之间的隆起叫回，它们大大增加了大脑的表面积;大脑外侧面重要的沟、裂有大脑外侧裂、顶枕裂和中央沟。由于三沟裂之界隔，使大脑皮质组分为额叶、顶叶、颞叶、枕叶四大部分。神经干细胞具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。需要强调的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。神经干细胞作为干细胞的一种，它具有其它所有干细胞的基本特征：具有自我维持和自我更新能力，具有多种分化潜能，具有分化为本系统大部分类型细胞的能力，这种自我更新和分化潜能可以维持相当长的时间甚至终生，对损伤和疾病具有反应能力。神经干细胞在疾病、损伤状态下具有增殖、迁移，并向神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的能力，已成为神经系统损伤修复和再生研究的热点，体外建立稳定的神经干细胞培养模型是其基础和临床应用的前提。神经干细胞在培养3-4 d后，可形成神经球，神经球在培养基中呈悬浮生长，予以更换半量培基，1周后用吸管轻柔吹打球形克隆成为小的神经球和单细胞悬液，将部分细胞接种到新的培养瓶中，2×105个细胞/瓶，每7-10 d传代1次，每隔3 d离心更换半量培养基1次，培养条件不变。

实验工具

NSC神经干细胞完全培养基(IMP-R152-1)、NSC神经干细胞专用消化液 ( IMP-R152-1C )、PBS磷酸缓冲液、显微剪、微型剪刀、40 微米细胞筛、6 厘米培养皿、10 厘米培养皿、15 毫升离心管

操作过程

提前开启紫外线照射超净台30 分钟。将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 分钟。紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上。

1将新生小鼠(1-3天)放到6 厘米细胞培养皿盖上，喷酒精后放置超净工作台中。

2.在6 厘米培养皿中入2-3 毫升 PBS缓冲液

3.将新生鼠的头直接剪下来，放入PBS缓冲液中漂洗掉血渍

4.在6 厘米细胞培养皿中加入500-1000 微升 PBS缓冲液

5.取脑：用微型剪刀将脑沿中缝剪开脑皮和脑壳沿着开口起始处和终点处两边横向各剪一刀用剪刀将嗅球连接处挑断，把整个脑取出放入刚刚倒好的PBS缓冲液中。

6.取下丘脑神经干细胞:将整脑翻面，腹面朝上

下丘脑在整脑中间腹面突出部，沿着一条脑缝切三刀，边缘修整一下后，用镊子夹断2/3处，取上方(即腹面)2/3的脑

7.在6 厘米培养皿中加入500 微升 NSC神经干细胞专用消化液，将取好的下丘脑组织块放入其中，用镊子夹住刀片，切碎脑组识，直到没有大的组织块出现即可。.

8.补1500 微升的NSC神经干细胞专用消化液，将6 厘米培养皿盖上盖子放入培养箱中(37℃)消化20-30 分钟。

9.消化结束后加入PBS缓冲液稀释消化液，转移到15 毫升离心管中，最终PBS缓冲液的体积为消化液体积的3倍即可

10.吹打混匀后，置于离心机2000转，离心15分钟

11.用泵吸掉上清，尽量吸干净，加入NSC完全培养液(要分多少个孔就加多少毫升)

12.吹打混匀后，用40 微米细胞筛过滤入培养皿中，补2 毫升完全培养液夜即可

13.一般一周后分细胞

细胞传代

悬浮细胞 (6厘米培养皿)

1.将上清吸入15 毫升管中

2.用1毫升 PBS缓冲液润洗2次，加入15 毫升管中

3.高心，2000 转，15 分钟 (水平离心机)

4.吸去上清，加入500 微升消化液，放入培养箱中横放5-10 分钟(消化好后，会变成絮状，轻轻吹打则变透明)

6.加入1500 微升 PBS缓冲液稀释消化液，吹打几次，至溶液变澄清

6.离心，转 rpm，5 分钟

7.吸去上清，用新鲜NSC培养基重悬，分盘

细胞冻存

消化后使用10% DMSO 的神经干细胞完全培养基冻存

细胞鉴定

1. 形态观察

神经干细胞一般都是悬浮培养的，会形成神经球

2. 标志物鉴定

小鼠下丘脑神经干细胞经Sox2及Nestin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上

3. 诱导实验

神经球培养和分化实验，染色要贴壁，需要加层粘连蛋白La分钟in或者poly-lysine，NSC可以分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞