第三节：小鼠小肠类器官冻存教程

时间：2023-05-26 09:19:36 点击：836次

一、冻存条件

当孔中小肠类器官群体增殖(占胶85%左右)，且平均直径为100-150 μm时，小肠类器官细胞状态良好时，即可冻存，每孔冻存一管。

二、准备工作

1.预冷5 mL Immocell Reactive detergent medium, Immocell Antibacterial detergent ,Organoid cryopreservation fluid，准备相应数量的2 mL冻存管;标记细胞名称，代次，日期，操作人;

2.提前从4℃冰箱中取出Immocell Organoid cryopreservation fluid冻存液，置于室温预温，提前将梯度程序降温盒置于4℃冰箱中预冷;

三、细胞冻存

1.从培养箱中取出待传代小肠类器官细胞，吸弃孔内的培养液，加入500 μL/孔的Immocell Reactive detergent medium，用经过Immocell Anti-Adherence Solution润洗的枪头吹打和刮取类器官，并将悬液转移至经过润洗的1.5 mL EP管中。

2.经过Immocell Anti-Adherence Solution润洗的枪头用力吹打和重悬类器官悬液，10-15次，使得类器官与基质胶分离。200-300g离心3-5 min，离心后可见培养基，基质胶，类器官沉淀从上至下分三层;

3. 用Immocell Antibacterial detergent清洗类器官细胞一次(混匀后200-300g离心3-5 min，弃去上清液)以除去培养液;

4.向准备冻存的小鼠小肠类器官中加入1mL Organoid cryopreservation fluid,吹打混匀后迅速转移至冻存管中;

5. 将冻存管放入细胞冻存程序降温盒内，随后迅速将细胞冻存程序降温盒放入-80℃超低温冰箱中，24 h后将冻存管转移至液氮(-196℃)中长期保存。