第四节：小鼠小肠类器官复苏教程

时间：2023-05-27 09:19:28 点击：579次

一、准备工作

1. 将恒温水浴锅调至37℃预热，根据实验用量，提前解冻分装好的基质胶。

2. 准备200 μL无菌吸头1盒，无菌的1.5 mL EP管，放入EP冰盒上，均置于-20℃冰箱中预冷1小时以上;

3. 取15 mL离心管，并做上标记;吸取10 mL DMEM/F12 培养基加到离心管中;

4. 取15 mL离心管，并做上标记;吸取1 mL Immocell MLDT organoid 完全培养基加到离心管中;按照1:1000比例加入1 μl的Immocell Y-27632(10 mM)，充分混匀，恢复至室温;

注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基

二、小肠类器官细胞复苏

1.从液氮罐中取出待复苏的小肠类器官细胞，转移置于干冰泡沫箱中，取出一支待复苏的小肠类器官细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出;75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，放入生物安全柜;

2.将类器官细胞悬液移至15 mL离心管中，随后缓慢加入10 mL DMEM/F12，轻柔晃动混匀细胞，200-300 g离心3-5 min;

3.离心完后可看到离心管底部有细胞沉淀，将离心好的细胞置于生物安全柜中，吸弃上清，尽量吸尽，但是注意不要吸起细胞沉淀，加入预温的1mL Immocell Reactive detergent medium，重悬细胞沉淀，200-300 g离心3-5 min;此步骤重复2次，以除去残留冻存液。

4.按照每孔500-2000个隐窝对应25 μL Matrigel的比例计算加入相应的基质胶，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

5. 用移液器吸取Matrigel和细胞的混合液移至细胞培养孔板中(24孔板每孔点加25uL)，混合悬液须点至培养孔底部中央，沿着边缘铺开，其铺开后不可接触培养孔侧壁。

6.将培养板放入37℃，5% CO2细胞培养箱中凝固10-15min，待基质胶凝固至不流动后，沿着孔壁缓慢加入Immocell MLDT organoid 完全培养基，每孔加500 μL，做好标记(日期，代次，操作人)，每2天更换培养基。

7.将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每2天于显微镜中观察小鼠小肠类器官的生长状态并拍照，记录多个视野中的小鼠小肠类器官的形态和分布。

三、注意

在Matrigel点加至培养板中时，要记得沿着胶滴边缘铺开，保证中心和边缘胶的均匀性，否则会由于营养的吸收不均一，导致小肠类器官培养生长状态不一致。

在显微镜下观察，小肠类器官形态表面边缘清晰，而表面有出现松散裂解的状态则为死细胞或活力较低的细胞。