研究背景
成年哺乳动物的非角质细胞的无限繁殖培育在基因和细胞疗法以及再生和个性化医学上提供巨大潜能。
目前基本不可能实现腺体细胞体外传代和扩增并保持其细胞属性且使其能够正常生长和分化,其主要原因是细胞的衰老问题。虽然目前已经有科学手段能够克服细胞衰老的问题,但是同时引起新的问题。其一,使用人乳头瘤病毒蛋白E6/E7构建的细胞系导致p53和Rb信号通路的异常。其二,使用过表达外源的人的端粒酶逆转录酶(hTERT)使细胞失去分化能力。其三, iPS技术可以延长细胞的寿命,但是效率较低,且需要引入外源基因从而导致细胞基因组的改变和细胞抗原性改变。因此,目前尚未出现有效的科学方法实现表皮细胞的体外扩增并保持其应有的细胞属性。
Richard Schlegel团队利用基底细胞和Rho相关激酶抑制剂Y-27632成功在体外扩增原代人的角质形成细胞。若无基底细胞仅存在合成培养基的情况下能产生有限的非角质细胞,但是这些细胞不能无限增殖。该团队发现这种基底细胞加抑制剂的培养方法可以条件性重编程培养正常和癌变的表皮细胞,使其保持快速增殖的特性且在移除这种培养条件下具有重新分化的能力。
结果与方法
一、条件性重编程系统能够成功扩增多种原代细胞和原位肿瘤细胞
作者通过使用Swiss 3T3 J2 细胞和Y-27632抑制剂经过条件性重编程(图1A)的流程培养正常的前列腺,乳腺,气管细胞和肝癌细胞,发现这些细胞能够在这种条件下进行快速增殖,并在5天细胞长满培养皿。并且这些细胞能够在与基底细胞接触地方形成类似表皮的边界。
条件性重编程培养系统需要基底细胞和Rho相关激酶抑制剂Y-27632。通过对前列腺细胞和乳腺细胞的培养发现:当只有抑制剂时,细胞获得非常有限的增殖,且与单独培养基组无太大差异;当基底细胞的存在时,前列腺和乳腺细胞获得相对较好的增殖,但是增殖也是受限的;同时存在基底细胞和抑制剂时,细胞能够获得快速、不受限制的增长(图1B)。
二、对后期乳腺和前列腺细胞的鉴定
将体外条件性重编程培养的乳腺和前列腺细胞转移至角质形成细胞的培养基中培养时,正常乳腺细胞和前列腺细胞能够分化形成前列腺球和乳腺细胞球,然而通过表达Myc T58A和hTERT的乳腺癌细胞则形成实体的球形细胞团(图2A)。
作者之前的研究表明,基底细胞能够诱导端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达。通过对前列腺细胞中的mRNA进行定量分析发现,加入基底细胞后hTERT的表达量显著上升。在加入抑制剂后,hTERT的表达量呈增强的趋势(图2B)。乳腺和前列腺细胞中hTERT的诱导程度相似,在细胞培养的早期被迅速诱导表达(图2C)。因为现有的永生化细胞的方案会导致细胞基因组的改变。因此,作者通过对染色体进行分析和DNA足迹进行分析发现条件性重编程细胞均未见异常(图2D和E)。
三、建立的癌变和正常前列腺细胞的培养
为了能够为基因组学、生物化学以及药物筛选提供相互匹配的正常细胞和癌变细胞的培养。作者把同一个病人体内的正常的前列腺组织细胞和恶性癌变的腺体组织细胞进行条件性重编程培养。在条件性重编程培养的情况下(2D培养),正常组织细胞和癌变细胞并没有明显差异(图3)。但是当细胞转移至角质生成细胞培养基(Matrigel)中培养时(3D培养),正常前列腺细胞形成规则的腺体球形细胞,而癌变的细胞则形成不规则的细胞团。并且当把这两类培养的细胞免疫缺陷的小鼠皮下时,条件性重编程培养的癌变细胞能够有效的发展成为肿瘤,而培养的正常的前列腺体细胞则不会发展成为肿瘤(图3)。
四、人的原代细胞克隆形成效率
作者将获得人的原代角质生成细胞和宫颈癌细胞进行条件性重编程培养7-10天,最后通过利用结晶紫对活细胞克隆进行鉴定,发现人的原代细胞形成效率在40%-70%左右。
总结与讨论
关于条件性重编程培养的机理尚未有明确的研究。但是,通过对以往研究的总结和类比,作者认为条件性重编程直接改变细胞的生长,而非筛选出一小部分具有干细胞特性的细胞。人的乳头瘤病毒诱导细胞的永生化需要两个重要蛋白的参与,E6和E7。其中E6能够诱导诱导端粒酶逆转录酶(hTERT)的高表达;另一个E7能够抑制Rb信号通路的激活。与之类似,第一,作者在图2B中证明F培养基和基底细胞能够有效诱导hTERT的表达(图5左侧);第二,在条件性重编程培养中,作者使用了Rho相关激酶抑制剂Y-27632,其能够调节细胞骨架蛋白的信号通路从而促进细胞增殖,另外也能通过抑制p16/Rb信号通路从而促进细胞增殖(图5右侧)。
作者通过基底细胞和抑制剂而非引入外源基因而实现了细胞的体外扩增;并能够保持细胞的正常特性而非像hTERT永生化的细胞形成无规则的细胞团;能够提供用之不竭的病人特异性的细胞用于基因或小分子筛选。
大家都在看
-
细胞冻存步骤视频操作:1.将细胞培养皿放入超净工作台,吸去上清,沿皿壁加入5ml PBS,轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS吸去;2.加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落,可轻拍使未脱落细胞脱落加入3m···...
阅读详情 -
贴壁细胞传代培养视频步骤:1:将细胞培养皿放入超净工作台中,吸去上清,沿血壁加入5ml PBS;2:轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS弃去;3:加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落;4:加入3ml完全培养基终···...
阅读详情 -
细胞复苏视频步骤:1.从液氮罐中迅速取出冻存管,立即放入37°C水浴箱中;2.轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻,最好在1min内完成;3.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min;4.取4mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养皿上···...
阅读详情 -
T25瓶细胞运输收货视频处理:1.吸出运输用培养基,加入5m」1xPBS清洗1遍,去掉PBS,加入2m1胰酶消化,并放入培养箱孵育1-2min;2.在显微镜下观察细胞是否脱落,加入3mI完全培养基终止消化,轻轻吹打细胞,使其脱离瓶壁3.细胞悬···...
阅读详情 -
冻存细胞运输收货处理视频操作步骤:1.提前打开水浴锅设置37C,将取出的冻存管迅速放入37C水浴锅中,轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻2.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min3.取3mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养···...
阅读详情 -
第四课:重编程人的内皮细胞至造血干细胞需要血管的诱导视频:在本篇研究中,作者发现一套转录因子的组合能够使人的脐带内皮细胞和成人真皮微血管内皮细胞转化为具有多功能干性的造血细胞,内皮细胞的诱导需要无血清血管···...
阅读详情
相关问答
-
细胞增殖速度怎么变得这么慢了?细胞发生病变,出现细胞变圆、从培养瓶壁脱落又是什么情况?要疯了,培养细胞怎么就这么难呢~实验过程中存在的“幽灵”,即使是经验丰富的老研究员也不得不面对,没错,它就是支原体感···...
阅读详情 -
胎牛血清和小牛血清的差别在哪里? 胎牛血清和小牛血清的差别在哪里? 胎牛血清(FBS) :从八月龄胎牛心脏穿刺取血。适用于专业的研究和试验,包括干细胞研究、免疫分析和抗体生产。 新生牛血青/小牛血清(NBCS) :从自出···...
阅读详情 -
适合细胞长期保存的温度是多少? 适合细胞长期保存的温度是多少? 细胞长期保存温度是-130°C或更低。液氮罐中气态层温度在-140°C至-180°C之间细胞可保存在气态层或浸入液氮中,如果可以最好保存在气态层,因为这样···...
阅读详情 -
如何在细胞铺板时避免“边缘效应”? 如何在细胞铺板时避免“边缘效应”? 以下这三点一定要注意!细胞实验铺板时,为避免“边缘效应”,以应用96孔板的中间60孔为最佳,一般四周的一圈边缘孔不养细胞,只做空白或阴性···...
阅读详情 -
如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候?如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候?用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满90%的时候,这时细胞生长状态好,细胞数量也多并且在收获细胞前24小时换一次培养液。收获用来冻···...
阅读详情 -
培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用?培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用?几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以各种培养液中都含有较大量的谷···...
阅读详情