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逸漠细胞学堂

第六课：拟永生化产后耳蜗组细胞产生足量细胞系且具有调控毛细胞转录的能力

时间：2021-12-17 09:31:00 点击：871次

研究背景

听觉毛细胞(HC)是耳蜗中机械感应细胞对听力具有至关重要的作用。毛细胞是高度分化且丰度较低的一类细胞，每个小鼠耳蜗仅有3300个毛细胞。毛细胞分为内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。OHC是电动的而且起耳蜗放大器的作用。然而OHC的电动性由prestin蛋白决定。但是，关于prestin蛋白的调控却研究较少，主要原因在于缺乏合适研究prestin的系统。

虽然，可以通过“immorto-mouse”产生毛细胞的细胞系，但是这类细胞在表型上与原代的毛细胞还是存在着明显的表型差异。因此，作者利用报道的体外重编程培养技术(CR)培养耳祖细胞(CR-OSCs)并对其进行相关的鉴定和研究，发现其能够有效表达分化后的毛细胞相关标识物，特别是终端分化的基因prestin。

实验数据

一、条件性重编程代系限制的耳干细胞

前期的研究是通过条件性重编程培养乳腺和包皮细胞，作者猜想可以利用该条件性重编程技术来培养柯蒂氏器(听觉感受器)。作者从小鼠体内分离耳部表皮细胞进行条件性重编程培养，发现培养7天后，基底细胞上形成鲜明的细胞群落(图1A和B)。为了能够区分基底细胞和培养的细胞克隆，作者从Rosa26-CAG-TdTomato小鼠里分离出耳部细胞，并且通过免疫荧光可以观察到细胞群落都是红色的克隆(图1C)，由此可见形成的细胞群落来自培养的细胞而非基底细胞。此外，作者研究其他的细胞是否也可以充当基底细胞的作用，按照条件性重编程培养的方法，作者将丝裂霉素处理的NIH3T3和MEF细胞作为基底细胞，并添加Rock抑制剂，培养小鼠耳表皮细胞。虽然也有部分细胞群落形成，但是生成速度慢而且经过第二次传代后没有新的细胞克隆生长(图1D和E)。

二、条件性重编程耳干细胞的分析

作者进一步分析了条件性重编程的耳干细胞的特性。首先，作者通过连续10代传代培养，发现，细胞数是成线性增长的(图2A)。其次，作者论证条件性培养的细胞增殖会不会随代数改变。通过比较不同代数细胞增殖产生的细胞数，作者发现虽然细胞数有波动，但是整体保持相对稳定(图2B)。再者，细胞获得维持稳定的增殖需要保持其端粒酶的活性，因此通过检测条件性重编程细胞的端粒酶的活性发现细胞培养7天后(第二代后)细胞的端粒酶的活性明显上调(图2C)。最后，作者通过比较条件性重编程培养和体外耳表皮细胞培养，发现七天后两种培养条件细胞数相似，说明条件性重编程整体激活了耳细胞的增殖能力(图2D)。

三、条件性重编程的耳干细胞在分化条件下上调毛细胞特异性基因

将条件性重编程的耳干细胞在分化条件下，作者研究其毛细胞分化的表面分子标志物，发现高表达Myo6(图3A)。其次，研究这类细胞是否分化产生Prestin，作者将YFP-Prestin小鼠细胞进行相同出发，发现条件性重编程后的细胞在分化条件下也能产生Prestin(图3B)。当共同染色Myo6和Prestin时，作者发现所有Prestin阳性的细胞都是Myo6。因此，作者推测Myo6阳性细胞中存在部分细胞分化产生Prestin阳性的细胞(图3C)。

为了更好的定性研究毛细胞分化的表面分子标志物，做利用定量PCR检测了Atoh1, Pou4f3, Myosin 6, Myosin 7a, Parvalbumin, Otoferlin, VGlut3, Prestin。作者发现在这些分子在培养的第1代和第14代都有表达，并且其中Atoh1， Pou4f3， Myosin6， Myosin7a， Parvalbumin， Prestin的表达在第14代显著提高。

四、细胞代数对CR-OSCs细胞在分化条件性下转录的影响

本篇前期的结果已经证明，耳干细胞能够在体外进行条件性重编程培养，且能够进行重复传代。因此，作者研究在不同代数中，毛细胞的表面分子的变化(图4)。作者发现除了Myosin 7a和Myosin 6在培养的第1代和第5代有显著下调(图4C和D)，其他的分子维持相对稳定(图4A-B，E-H)。

五、过表达Atoh1后CR-OSC能够上调Pou4f3, Myosin VI和 Otoferlin

研究表明，Atoh1能够上调毛细胞特异性的基因，并且驱使未成熟的毛细胞分化。因此，作者利用AAV载体过表达Atoh1研究其对耳干细胞的影响。其中HEI-OC1能够表达部分毛细胞表明标识物的耳细胞系，HEK是人的肾上皮细胞作为阴性对照。发现过表达Atoh1能够诱导Pou4f3和Myosin6以及Otoferlin的表达(图5)。并且与之前的研究一致，过表达Atoh1不能够诱导Prestin的表达(图5G)。

过表达Atoh1后CR-OSC能够上调Pou4f3, Myosin VI和 Otoferlin图片

六、甲状腺激素处理能够诱导CR-OSC上调Prestin

甲状腺激素能够诱导Prestin的表达。甲状腺激素有三种类型，其中包括四碘甲腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)。作者分别使用T4和T3处理条件性重编程的耳干细胞，利用qPCR检测Prestin的表达(图5)。作者发现条件性重编程的耳干细胞能够诱导Prestin的表达，但是HEI-OC1和HEK细胞系则不行。因此，条件性重编程的耳干细胞(CR-OSC)和外耳毛细胞(OHC)具有相似的特性，能在甲状腺激素处理后上调Prestin的表达。

总结与讨论

通过尝试体外条件性重编程培养，作者建立了体外扩增耳干细胞的。该系统能够非常高效的体外扩增耳干细胞。其优势主要集中以下三点：

第一，由一只耳蜗能产生数量庞大的细胞。

第二，培养体系简单。任何实验室都有望建立并使用。

第三，该培养体系是瞬时的且不改变细胞的基因组。

第四，利用不同的遗传学修饰的小鼠获得不同的条件性重编程耳干细胞。

第六课：拟永生化产后耳蜗组细胞产生足量细胞系且具有调控毛细胞转录的能力

研究背景

实验数据

总结与讨论

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