研究背景
角质生成细胞在体外与辐照的3T3基底细胞(J2)以及生长因子的作用,角质生成细胞能够获得持续的增殖能力并形成类似于“永生化”的结果。条件性重编程的细胞表达成熟干细胞的但是却有别于胚胎干细胞和诱导的多能性干细胞。为此,作者希望通过基因表达和功能性的siRNA敲除验证等方法验证条件性重编程细胞的变化。
实验结果
一、条件性重编程细胞周期的改变
Rho 抑制剂Y-27632能够降低细胞的应力纤维和激动蛋白。然而,与Rho抑制剂共培养的角质生成细胞的生长却未受到影响。因此,作者分析了基底细胞、Rho抑制剂对角质生成细胞的影响。Rho抑制剂处理能够增加角质生成细胞的处于S期的比例,然而当同时用Rho抑制剂和J2基底细胞共培养,发现角质生成细胞中G2/M期细胞比例明显增加(图1A)。并通过WB检测细胞周期和干细胞相关蛋白发现,J2和Rho抑制剂共同培养虽然仍保留部分pRb,CyclinA,CyclinE,MCM4和pCDK1蛋白的表达,但是却能够诱导干细胞相关分子的表达,如p63,且下调表皮细胞相关分子的表达,如Involucrin(图1b)。
二、条件性重编程细胞基因表达特征谱
为了能够从全局角度去了解条件性重编程对角质生成细胞的影响,作者分析了角质生成细胞在Rho抑制剂,基底细胞作用下的基因表达谱。Rho抑制剂,J2基底细胞,Rho抑制剂和J2基底细胞在三种处理方式分别影响了角质生成细胞293,215和495个基因的表达。随后,作者对这些基因进行差异基因分析发现:第一,Rho抑制剂和J2基底细胞对角质生成细胞既有各自处理的特异影响也有协调影响(图2A)。第二,Rho抑制剂和J2基底细胞对角质生成细胞的作用主要是上调其增殖而降低其分化的生物学过程(图2B)。
三、利用siRNA库进行J2分泌因子的功能性筛选
基底细胞J2分泌的因子对条件性重编程起至关重要的作用。为此,作者借助siRNA库敲低分泌因子蛋白合成从而理清哪些分泌因子对条件性重编程起决定性作用。通过对332个基因的分析发现,其中14个基因的敲低显著抑制了角质生成细胞的生长。这些基因的功能主要涉及上调细胞的粘附,炎症反应,迁移以及增殖等。并且,其中有些基因,如Fstl3,Lefty1,Lefty2,是负调控TGF- β信号通路的(图3)。
四、条件性重编程细胞的翻译后调控
为了更好的诠释条件性重编程中细胞信号通路的改变,作者进行反相蛋白微阵列分析。基底细胞J2和Rock抑制剂上调了角质生成细胞的Akt的T308位点的磷酸化,而其他14个蛋白分子的磷酸化降低(图4A,B)。并且,特别值得注意的是,基底细胞J2和Rock抑制剂显著下调了Smad1/2/5的磷酸化(图4C)。
总结与讨论
条件性重编程技术能够体外扩增体细胞,特别是表皮细胞,为药物筛选和临床治疗提供巨大平台。但是关于条件性重编程中细胞的分子信号通路却未被阐明。
基底细胞J2和Rock抑制剂条件性重编程角质生成细胞重要是通过以下方面:
第一,通过上调Rb和CDK1的磷酸化促进细胞周期相关基因的表达从而促进细胞增殖;
第二,抑制细胞分化的发生。虽然之前的研究证明基底细胞能够抑制角质生成细胞的分化,但是当加入Rock抑制剂后,角质生成细胞的分化完全被阻断。
第三,TGF- β信号通路的抑制。之前关于胚胎干细胞的研究中提及TGF- β信号通路的抑制和细胞的增殖有关,这也预示TGF- β信号通路的抑制对条件性重编程也具有重要作用。
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