hESC(H1)人胚胎干细胞生长记录
| 一、细胞基本属性 | ||||
| 细胞名称 | hESC（H1）人胚胎干细胞（STR鉴定正确） | |||
| 细胞别称 | H1；人胚胎干细胞；WA01 | |||
| 种属来源 | 人/男性 | |||
| 组织年龄 | 内细胞团 | |||
| 生长特性 | 贴壁生长 | |||
| 细胞形态 | 球形克隆 | |||
| 背景简介 | hESC(H1)细胞株来源于健康男性内细胞团，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。 | |||
| 细胞代数 | 10代以内 | |||
| STR鉴定结果 | Amelogenim：X Y；D5S818：9，11；D13S317：8,11；D7S820：8，12；D16S539：9，13；vWA：15，17；THO1：9.3，13；TPOX：8，18；CSF1PO：12，13 | |||
| 细胞荧光检测 |  | |||
| 细胞规格 | 1×106cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装 | |||
| 支原体检测 | 无 | |||
| 培养基 | hESC/iPSC细胞培养试剂盒（IMC-014） | |||
| 冻存条件 | 无血清冻存液，液氮储存 | |||
| 细胞货期 | 现货，1周左右 | |||
| 发货方式 | 复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用） 顺丰快递 | |||
| 供应限制 | 仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用 | |||
| 特别说明 | 以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主 | |||
| 二、细胞培养操作 | ||||
| 试剂准备 | 1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL） 1.在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。 2.在生物安全柜中，使用无菌移液管将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 与 hESC/iPSC Basal Medium 混匀配制成 hESC/iPSC 完全培养基，之后根据使用情况将培养基分装，封口膜封好，确保置于 4℃储存的培养基 2 周内使用完毕，其余培养基于-20℃冷冻保存，需要时提前于 4℃过夜解冻。 2）Matrigel铺板（以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例） A. 分装 Matrigel1.货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。 2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。 3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。 注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。 4.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。5.混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。 6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。 B.铺板 1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。 2.1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（278μL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。 3.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。 4.用预冷吸头向解冻过的Matrigel（278μL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。 5.吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。 6.分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。 7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用，急用时可放置培养箱 40 分钟。 | |||
| 复苏方法 | 1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温。 2.取 2 mL hESC/iPSC 完全培养基，加入 4μL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为 10μM，取 9mL DMEM/F12，加入 18μL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为 10μM，恢复至室温。 注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。 3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入9mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。 5.吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培养基。 6.离心完吸弃上清，至留下 50μL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基，轻弹管底 3-4 下混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基中。 7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。
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| 传代方法 | 2）传代hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 传代条件： ① 细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示），一般情况下每 3-4 天传代； ② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。 注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。 2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度 85%，大小均匀（如图 1(C-D)所示），建议按照 1:8 进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。 注：1:8 传代就是 1 个孔传 8 个孔（以 6 孔板为例）。 3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。 4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为 10uM，恢复至室温（~25℃）。 5. 将细胞六孔板孔内培养基吸弃，加入 1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃后吸弃。 6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。 7. 置于 37℃培养箱中孵育 5-7 min。 注： ① 消化 5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间，不超过 8min； ② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。
图 2：消化 hESC(H1)细胞不同时间形态图：（A）消化 5 min 低倍镜 hESC(H1)培养的的形态图;（B）消化 6 min 低倍镜 hESC(H1)培养的的形态图。 8.消化时吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。 9.消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。及时加入 1 mL/孔预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，将细胞吹下来。 注：① 加 hESC/iPSC 完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C 时，可轻柔吹打细胞不能超过 2 次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 8min）。 10.把这一毫升细胞悬液悬空滴加入板里的培养基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人，水平十字摇匀 3 次。 注：可将传完代后的细胞在镜下观察细胞密度，根据密度调整是否需要多加细胞滴。 11.置于 37℃，5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀 3 次，不要叠放。 12. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，第 4 天继续传代/冻存。 注：传代后隔天算第 1 天。 | |||
| 注意事项 | 1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。 | 1.收货时若发现干冰化完，检查冻存管是否融化，若已融化需直接离心细胞接种观察，若未融化可以将细胞按正常步骤保存； 2.为保证细胞的高存活率，收到产品后，请立即解冻复苏细胞。 | ||
| 到货须知 | 1.收到细胞后，及时拍照记录有无漏液、浑浊或瓶身破损现象。 3.由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 4. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。 | |||
| 备注：客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术服务电话：400-080-3389 按 2，我们随时给予解答。 | ||||
| 三、细胞冻存操作 | ||||
| 冻存液配方 | 无血清冻存液，液氮储存 | |||
| 细胞密度 | 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例 | |||
| 冻存方法 | 3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。 2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。 3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。 4. 吸取上清液，加入1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。 5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时5-7 min（可参考“三（2）、传代hESC/iPSC”步骤）。 6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。 7.混匀含有终浓度为 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL，轻柔吹打，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。 8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。 | |||
| 注意事项 | 冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案 | |||
| 四、售后服务 | ||||
| 重发标准 | 1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发； 2.收到细胞未开封，如出现污染状况，重发； 3.收到细胞3天内，发现污染问题，经核实后，重发； 4.常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，绝大多数细胞未存活，经核实后，重发； 5.常温发货的细胞静置 22 小时并且未开封或干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，出现污染，经核实后，重发； 6.细胞活性问题，请在收到产品 3 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后，重发； 7.视具体情况而定。 | |||
| 不予重发 | 1.客户操作造成细胞污染，不重发； 2.客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发； 3.非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发； 4.细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发； 5.细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发； 6.收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于3天的，不重发； 7.视具体情况而定。 | |||
| 五、参考文献 | ||||
m6A modification-tuned sphingolipid metabolism regulates postnatal liver development in male mice. Nat Metab. 2023 May;5(5):842-860. doi: 10.1038/s42255-023-00808-9. Epub 2023 May 15. PMID: 37188818. 作者：Wang S, Chen S, Sun J, Han P, Xu B, Li X, Zhong Y, Xu Z, Zhang P, Mi P, Zhang C, Li L, Zhang H, Xia Y, Li S, Heikenwalder M, Yuan D. 细胞：H1-hESCs 2024年影响因子/JCR分区：20.8/Q1 | ||||
