hiPSC人多能干细胞生长记录
| 一、细胞基本属性 | ||||
| 细胞名称 | hiPSC人多能干细胞（STR鉴定正确） | |||
| 细胞别称 | hiPSC；人类诱导多能干细胞；人多能干细胞 | |||
| 种属来源 | 人/男性 | |||
| 组织年龄 | 内细胞团 | |||
| 生长特性 | 贴壁生长 | |||
| 细胞形态 | 球形克隆 | |||
| 背景简介 | hiPSC细胞株来源于ATCC，是将健康男性新生儿包皮细胞诱导成hiPSC，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。 | |||
| 细胞荧光检测 |  人多能干细胞hiPSC培养鉴定实验报告下载 | |||
| STR鉴定 | ||||
| 细胞规格 | 1×106cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装 | |||
| 支原体检测 | 无 | |||
| 培养基 | hESC/iPSC细胞培养试剂盒（IMC-014） | |||
| 冻存条件 | 无血清冻存液，液氮储存 | |||
| 细胞货期 | 现货，1周左右 | |||
| 发货方式 | 复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用） 顺丰快递 | |||
| 供应限制 | 仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用 | |||
| 特别说明 | 以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主 | |||
| 二、细胞培养操作 | ||||
| 试剂准备 | 1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL） 1.在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。 2.在生物安全柜中，使用无菌移液管将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 与 hESC/iPSC Basal Medium 混匀配制成 hESC/iPSC 完全培养基，之后根据使用情况将培养基分装，封口膜封好，确保置于 4℃储存的培养基 2 周内使用完毕，其余培养基于-20℃冷冻保存，需要时提前于 4℃过夜解冻。 2）Matrigel铺板（以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例）A. 分装 Matrigel 1.货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。 2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。 3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。 注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。 4.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。5.混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。 6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。 B.铺板 1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。 2.1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（278μL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。 3.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。 4.用预冷吸头向解冻过的Matrigel（278μL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。 5.吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。 6.分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。 7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用，急用时可放置培养箱 40 分钟。 | |||
| 复苏方法 | 1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 将水浴锅预热至 37℃；并将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温。 2. 取 2 mL hESC/iPSC 完全培养基，加入 4μL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为 10μM，取 9mL DMEM/F12，加入 18μL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为 10μM，恢复至室温。 注意：不要在 37℃水浴锅中预温培养基。 3. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min 内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。 4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入 9mL DMEM/F12，将离心管轻轻缓慢上下颠倒混匀，160g离心 5 min。 5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培养基。 6. 离心完吸弃上清，至留下 50μL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基，轻弹管底 3-4 下混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基中。 7. 水平十字摇匀三次，置于 37℃，5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。 注：水平十字摇匀 3 次，左右两次+上下两次算一次。 8. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，之后每天更换培养基。
| |||
| 传代方法 | 2）传代hESC/iPSC（以6孔板为例）
图 1：传代第 1 天和第 4 天的细胞状态（A）hiPSC 4 倍镜下第 1 天的状态；（B）hiPSC 4 倍镜下第 4 天的状态；（C）hiPSC 10 倍镜下第 1 天的状态；（D）hiPSC 10 倍镜下第 4 天的状态。 1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。 注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。 2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(B-D)所示），建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。 注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔（以6孔板为例）。 3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。 4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。 5. 将细胞六孔板孔内培养基吸弃，加入 1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃后吸弃。 6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。 7. 置于 37℃培养箱中孵育 5-7 min。 注：① 消化 5-7 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<10 min）。 ② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。
图 2：消化 hiPSC 细胞不同时间形态图：（A）消化 5 min 低倍镜 hiPSC 培养的的形态图;（B）消化 6 min 低倍镜hiPSC 培养的的形态图。 8.消化时，吸弃含有 Matrigel 的铺板培养基 9. 消化结束后，轻轻拍打板侧（每侧拍两下），把细胞拍下来，再在生物安全柜中，加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基终止消化，把这 2mL 体系吸入 15mL 离心管离心 200g 1min，吸弃上清至剩余几十微升，轻弹孔底 3-4 下，让细胞沉淀溶于上清，往孔板里加 2mL 培养基，再加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基到含有细胞的 15mL 离心管里，轻弹 3-4 下，混匀即可，把这一毫升细胞悬液悬 空滴加入板里的培养基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人，水平十字摇匀 3 次。 注：可将传完代后的细胞在镜下观察细胞密度，根据密度调整是否需要多加细胞滴。 10.置于 37℃，5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀 3 次，不要叠 放。 11. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，第 4 天继续传代/冻存。 注：传代后隔天算第 1 天。 | |||
| 注意事项 | 1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。 | 1.收货时若发现干冰化完，检查冻存管是否融化，若已融化需直接离心细胞接种观察，若未融化可以将细胞按正常步骤保存； 2.为保证细胞的高存活率，收到产品后，请立即解冻复苏细胞。 | ||
| 到货须知 | 1.收到细胞后，及时拍照记录有无漏液、浑浊或瓶身破损现象。 3.由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 | |||
| 备注：客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术服务电话：400-080-3389 按 2，我们随时给予解答。 | ||||
| 三、细胞冻存操作 | ||||
| 冻存液配方 | 无血清冻存液，液氮储存 | |||
| 细胞密度 | 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例 | |||
| 冻存方法 | 3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。 2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。 3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。 4. 吸取上清液，加入1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。 5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min（可参考“三（2）、传代hESC/iPSC”步骤）。 6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸弃hESC/iPSC Passage Solution。 7.混匀含有终浓度为 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL，轻柔吹打，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。 8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。 | |||
| 注意事项 | 冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案 | |||
| 四、售后服务 | ||||
| 重发标准 | 1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发； 2.收到细胞未开封，如出现污染状况，重发； 3.收到细胞3天内，发现污染问题，经核实后，重发； 4.常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，绝大多数细胞未存活，经核实后，重发； 5.常温发货的细胞静置 22 小时并且未开封或干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，出现污染，经核实后，重发； 6.细胞活性问题，请在收到产品 3 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后，重发； 7.视具体情况而定。 | |||
| 不予重发 | 1.客户操作造成细胞污染，不重发； 2.客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发； 3.非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发； 4.细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发； 5.细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发； 6.收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于3天的，不重发； 7.视具体情况而定。 | |||
