| 一、细胞基本属性 | ||||
| 细胞名称 | hiPSC人多能干细胞（STR鉴定正确） | |||
| 细胞别称 | hiPSC；人类诱导多能干细胞；人多能干细胞 | |||
| 种属来源 | 人/男性 | |||
| 组织年龄 | 内细胞团 | |||
| 生长特性 | 贴壁生长 | |||
| 细胞形态 | 球形克隆 | |||
| 背景简介 | hiPSC细胞株来源于ATCC，是将健康男性新生儿包皮细胞诱导成hiPSC，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。 | |||
| 细胞荧光检测 |  | |||
| 流式鉴定 |  | |||
| STR鉴定 |
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| 细胞规格 | 1×106cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装 | |||
| 支原体检测 | 无 | |||
| 培养基 | hESC/iPSC细胞培养试剂盒（IMC-014） | |||
| 冻存条件 | 无血清冻存液，液氮储存 | |||
| 细胞货期 | 现货，1周左右 | |||
| 发货方式 | 复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用） 顺丰快递 | |||
| 供应限制 | 仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用 | |||
| 特别说明 | 以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主 | |||
二、hiPSC细胞培养操作步骤
试剂准备：
1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL）
1. 在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A，或在2°C至8°C下解冻过夜，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。
2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于2°C至8°C储存，封口膜封好后2周内使用。
3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。
4. 使用前，将当天所需的完全培养基在室温下预热至不再感觉冰凉。或者，可将当天使用的小份培养基在 37°C 水浴中预热至不再感觉冰凉。避免在 37°C 下长时间放置。复溶后，完全培养基可分装并在 -5°C 至 -20 °C 下储存长达 6 个月。或者，可将补剂分装成使用量大小的小份，并在 -5 至 -20 °C 下冷冻储存长达 6 个月。避免多次冻融循环。
表 1：hESC/iPSC完全培养基配置说明*
组分 | 500 mL | 100 mL | 50 mL |
hESC/iPSC Basal Medium | 450 mL | 90mL | 45 mL |
hESC/iPSC Grouth Supplements A | 50 mL | 10 mL | 5 mL |
可根据实际用量将hESC/iPSC Grouth Supplements A分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表3的配置说明。 hESC/iPSC Grouth Supplements A冻融总次数不能超过2次。
2）基质胶铺板（以包被6孔板为例）
A. 分装基质胶（IMV-A026）
1. 基质胶建议铺板浓度为1μL/ cm2，以六孔板为例，六孔板一孔底面积约为10cm2，铺板所需基质胶为10μL，一般按包被四个六孔板的量分装基质胶，即240μL/管，5mL基质胶可以分装约21管。
2. 准备21个无菌1.5 mL EP管，标记基质胶日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。
3. 将基质胶放置4℃冰箱过夜解冻，当基质胶完全解冻即可开始分装。
注：在解冻时，将基质胶放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。
4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的基质胶、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。
5. 混匀基质胶，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。
6. 将分装后的基质胶置于-20℃冰箱中保存。
B. 铺板
1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记基质胶批号、日期和操作人。
2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的基质胶（240μL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。
3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的基质胶、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。
4. 用预冷吸头向解冻过的基质胶（240μL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。
5. 吸出已解冻混匀的基质胶加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打约20次，混匀。
6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。
7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用，急用时可放置培养箱40分钟。
三、细胞培养操作：
1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15-30℃）。
2. 取3 mL hESC/iPSC完全培养基，加入6 μL hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，取9 mL含有hESC/iPSC Supplement C的DMEM/F12,加入18 μL hESC/iPSC Supplement C使终浓度为10uM，恢复至室温（15-30℃）。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出（冰晶剩绿豆大小时）。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。
5.吸弃六孔板内的铺板液，将2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基靠壁缓慢加入六孔板孔中。
6. 离心完吸弃上清，至留下 50uL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基，轻弹管底 3-4 下 混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基中。
7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
注：水平十字摇匀3次，左右两次+上下两次算一次
8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。
注：在hiPSC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。
表2：hESC/iPSC传代&培养操作试剂推荐用量
培养容器（孔数） | 底面积 | DPBS （mL） | 传代工作液 | hPSC培养基* |
6孔板（1管/1孔） | 9.6 cm2/孔 | 2mL/孔 | 2 mL/孔 | 2 mL/孔 |
12孔板（1管/2孔） | 4.5 cm2/孔 | 1mL/孔 | 1 mL/孔 | 1 mL/孔 |
24孔板（1管/4孔） | 8 cm2/孔 | 0.5mL/孔 | 0.5 mL/孔 | 0.5 mL/孔 |
2）传代hESC/iPSC（以6孔板为例）
图1. hESC/iPSC完全培养基连续培养hiPSC细胞形态图：（A）和（B）分别为hiPSC细胞培养第2和4天时低倍镜hiPSC培养形态图示，（C）和（D）为培养至第2和4天时的高倍镜hiPSC培养形态图。
1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；
② 细胞汇合度较高，集落变得过于密集或过大；③细胞集落分化增多。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
1. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5-1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(B-D)所示），建议按照1:10进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。
注：1:10传代就是1个孔瓶传10个孔（以6孔板为例）。
3. 将 Matrigel 包被的6孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（-25℃）。
4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔+1mL的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温（-25℃）。
5. 将孔内培养基吸弃，加入1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸弃。
6. 加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。
7. 置于37℃培养箱中孵育5-6 min。
注：① 消化5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（＜10min）。
② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
图2：消化hiPSC细胞不同时间形态图：（A）消化5 min低倍镜hiPSC培养的的形态图;（B）消化6 min低倍镜hiPSC培养的形态图。
8. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
9. 及时吸取1 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，快速轻柔吹打，利用枪头中的培养基吹打一次后，吸悬液再吹打一次，使细胞脱离基质。
注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。
② hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。
③吸弃hESC/iPSC Passage Solution，加入hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C后应快速吹打，避免细胞重新贴壁。
10. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
11. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。
12. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
13. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
注：传代后隔天算第一天
3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(B-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻2管。
2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时5-6 min（可参考“六（2）、传代hESC/iPSC”步骤）。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。
7. 摇匀hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入2 mL冻存液，轻柔吹打混匀，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
四、收货注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
5. 该细胞仅供科研使用。
