一、产品简介
hiPSC-CAS9细胞株是将含Cas9蛋白基因的载体转染进hiPSC细胞中，通过药物筛选，得到长期稳定表达的hiPSC-CAS9稳转细胞株。贴壁生长，呈克隆状，半药浓度H=50ug/ml，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。
该细胞株稳定表达Cas9核酸酶，通过转染 gRNA可实现基因敲除，转染 gRNA 和供体 DNA，可实现基因敲入/点突变。细胞系在体外长期培养可能导致部分细胞基因组发生改变，可能会降低 Cas9 的表达。因此，我们提供低代次(10 代以内)的细胞，保证实验效果。
为了维持 Cas9 基因表达量的稳定，建议传代时使用半药培养。
二、试剂准备
1)hESC/iPSC完全培养基配制(500 mL)
1. 在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。
2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。
3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。
表 1：hESC/iPSC完全培养基配置说明
可根据实际用量将hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表3的配置说明。 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B冻融总次数不能超过2次。
2)Matrigel铺板(以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例)
A. 分装 Matrigel
1. 货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。
2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人;1mL无菌吸头;EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。
3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。
注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。
4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。
5. 混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。
6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。
B. 铺板
1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。
2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解冻至完全化冻。
3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。
4. 用预冷吸头向解冻过的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。
5. 吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。
6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。
7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。
三、细胞培养操作
1)复苏hESC/iPSC(以6孔板为例)
1. 将水浴锅预热至37℃;并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(15~30℃)。
3. 取2 mL hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温(15~30℃)。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
4. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。
5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。 6. 吸弃上清，加入预温的2 mL的hESC/iPSC完全培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。
注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。
7. 吸除6孔板中1孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。
8. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
9. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。
注：在hiPSC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。
表2：hESC/iPSC传代&培养操作试剂推荐用量
2)传代hESC/iPSC(以6孔板为例)
1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)，一般情况下每3-4天传代;
② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
1. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀(如图1(C-D)所示)，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。
注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。
3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温(~25℃)。
5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
6. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。
7. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。
8. 置于37℃培养箱中孵育5-6 min。
注：① 消化5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
图1. hESC/iPSC完全培养基连续培养hiPSC-CAS9 细胞形态图：(A)和(B)分别为hiPSC-CAS9细胞培养第2和4天时低倍镜hiPSC培养形态图示，(C)和(D)为培养至第2和4天时的高倍镜hiPSC-CAS9培养形态图。
9. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
10. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。
注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。
图2：消化hiPSC细胞不同时间形态图：(A)消化5 min低倍镜hiPSC培养的的形态图;(B)消化6 min低倍镜hiPSC培养的的形态图。
② hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔(六孔板)。
11. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
12. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤8获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次;再按照传代比例接种。
13. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
14. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
3)冻存hESC/iPSC(以6孔板为例)
1. 当细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时5-6 min(可参考“六、传代hESC/iPSC”步骤)。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。
7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
四、收货注意事项
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
5. 该细胞仅供科研使用。
