一、产品简介
hiPSC-CAS9细胞株是将含Cas9蛋白基因的载体转染进hiPSC细胞中，通过药物筛选，得到长期稳定表达的hiPSC-CAS9稳转细胞株。贴壁生长，呈克隆状，半药浓度H=50ug/mL，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。
该细胞株稳定表达Cas9核酸酶，通过转染 gRNA可实现基因敲除，转染 gRNA 和供体 DNA，可实现基因敲入/点突变。细胞系在体外长期培养可能导致部分细胞基因组发生改变，可能会降低 Cas9 的表达。因此，我们提供低代次(10 代以内)的细胞，保证实验效果。
为了维持 Cas9 基因表达量的稳定，建议传代时使用半药培养。
二、试剂准备
1)hESC/iPSC完全培养基配制(500 mL)
1. 在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。
2. 在生物安全柜中，使用无菌移液管将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 与hESC/iPSC Basal Medium 混匀配制成 hESC/iPSC 完全培养基，之后根据使用情况将培养基分装，封口膜封好，确保置于 4℃储存的培养基 2 周内使用完毕，其余培养基于-20℃冷冻保存，需要时提前于 4℃过夜解冻。
2)Matrigel铺板(以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例)
A. 分装 Matrigel
1. 货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。
2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人;1mL无菌吸头;EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。
3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。
注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。
4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。
5. 混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。
6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。
B. 铺板
1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。
2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解冻至完全化冻。
3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。
4. 用预冷吸头向解冻过的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。
5. 吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。
6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。
7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用，急用时可放置培养箱 40 分钟。
三、细胞培养操作
1)复苏hESC/iPSC(以6孔板为例)
1. 将水浴锅预热至37℃;并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温。
2.取 2 mL hESC/iPSC 完全培养基，加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为10uM，取 9mL DMEM/F12，加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使终浓度为 10uM，恢复至室温。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入 9mL DMEM/F12，将离心管轻轻缓慢上下颠倒混匀，160g离心 5 min。
5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的hESC/iPSC 完全培养基。
6. 离心完吸弃上清，至留下 50uL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基，轻弹管底 3-4 下混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基中。
7. 水平十字摇匀三次，置于 37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
注：水平十字摇匀 3 次，左右两次+上下两次算一次。
8. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，之后每天更换培养基。
表1：hESC/iPSC传代&培养操作试剂推荐用量
| 培养容器（孔数） | 底面积 | DPBS （mL） | 传代工作液 | hPSC培养基* |
| 6孔板（1管/1孔） | 9.6 cm2/孔 | 1mL/孔 | 1 mL/孔 | 2 mL/孔 |
| 12孔板（1管/2孔） | 4.5 cm2/孔 | 0.5mL/孔 | 0.5 mL/孔 | 1 mL/孔 |
| 24孔板（1管/4孔） | 2 cm2/孔 | 0.3mL/孔 | 0.3 mL/孔 | 0.5 mL/孔 |
2)传代hESC/iPSC(以6孔板为例)
图 1：传代第 1 天和第 4 天的细胞状态（A）hiPSC CAS9 4 倍镜下第 1 天的状态；（B）hiPSC CAS9 4 倍镜下第4 天的状态；（C）hiPSC CAS9 10 倍镜下第 1 天的状态；（D）hiPSC CAS9 10 倍镜下第 4 天的状态。
1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)，一般情况下每3-4天传代;
② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀(如图1(C-D)所示)，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。
注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。
3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度10uM，恢复至室温(~25℃)。
5. 将细胞六孔板孔内培养基吸弃，加入 1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃后吸弃。
6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。
7. 置于 37℃培养箱中孵育 5-7 min。
注：
① 消化 5-7 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；hiPSC CAS细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<10 min）。
② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。
图 2：消化 hiPSC CAS9 细胞不同时间形态图：（A）消化 6 min 低倍镜 hiPSC CAS9 培养的的形态图;（B）消化 7min低倍镜 hiPSC CAS 培养的的形态图。
8.消化时，吸弃含有 Matrigel 的铺板培养基
9. 消化结束后，轻轻拍打板侧（每侧拍两下），把细胞拍下来，再在生物安全柜中，加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基终止消化，把这 2mL 体系吸入 15mL 离心管离心 200g 1min，吸弃上清至剩余几十微升，轻弹孔底 3-4 下，让细胞沉淀溶于上清，往孔板里加 2mL 培养基，再加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基到含有细胞的 15mL 离心管里，轻弹 3-4下，混匀即可，把这一毫升细胞悬液悬空滴加入板里的培养基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人，水平十字摇匀 3 次。
注：可将传完代后的细胞在镜下观察细胞密度，根据密度调整是否需要多加细胞滴。
10.置于 37℃，5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀 3 次，不要叠放。
11. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，第 4 天继续传代/冻存。
注：传代后隔天算第 1 天。
3)冻存hESC/iPSC(以6孔板为例)
1. 当细胞汇合度达85%左右(如图1(B-D)所示)可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入1 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入1 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时5-7 min(可参考“三（2）、传代hESC/iPSC”步骤)。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸弃hESC/iPSC Passage Solution。
7.混匀含有终浓度为 10uM 的 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL，轻柔吹打，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
四、收货注意事项
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
5. 该细胞仅供科研使用。
