产品信息
| 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 储存 |
| CELLTEKTM细胞种属鉴定检测试剂盒 | IMC-C01-50 | 50 rxns | -20℃保存2年 |
| CELLTEKTM细胞种属鉴定检测试剂盒 | IMC-C01-100 | 100 rxns | -20℃保存2年 |
试剂盒组成
| Component | IMC-C01-50 | IMC-C01-100 | |
| Species Positive Control Templates Mix | 100μl | 200μl | |
| Cell Extraction Buffer | 750μl | 1.5ml | |
| PCR Master Mix(2×) | 500μl | 1ml | |
| DNA Primers Mix | Homo Sapiens | 50μl×3管 | 100μl×3管 |
| Rattus Norvegicus | |||
| Mus Musculus | |||
| Nucleic Acid Free Water | 500μl | 1mL | |
产品简介
WHO、FDA、欧洲药典及中国药典都规定了对于生产用细胞应进行细胞鉴定检查，以确认细胞系的起源，检测是否存在其他细胞系的污染。细胞种属鉴定检测试剂盒利用线粒体基因细胞色素氧化酶I（COI）作为生物制品生产常用的细胞系的分子鉴定靶标，使用特异性引物对靶基因进行扩增，通过PCR联合琼脂糖凝胶电泳技术，根据扩增子的数量和条带大小进行物种鉴定和交叉污染检测。经验证交叉污染检测限可达到1%及以下，可在同一个反应中同时检测人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）3个物种，如需进一步验证，其产物还可用于一代测序，测序引物使用SeqPh（Homo sapiens）、SeqPr（Rattus norvegicus）、SeqPm（Mus musculus）。
本产品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的种属，针对人、大鼠、小鼠DNA序列保守区域设计特异引物，直接使用细胞培养液作为模板，特异性扩增待测细胞DNA，具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高的特点（结果见图1、图2）。
| 图1 | 图2 |
 |  |
| 1、negative control阴性对照 2、positive control阳性对照 | |
| 3、human人 4、rat大鼠 | |
| 5、mouse小鼠 6、rat sample大鼠细胞样品 | |
| 7、mouse sample小鼠细胞样品 | |
操作过程
1.制备细胞基因组 DNA 提取液（样品制备区）：
a、细胞准备
待细胞培养2-3天，生长至汇合度80%左右时，吸去培养液并消化细胞，加培养基终止消化后，取5E+05个（细胞总数）新鲜培养的待测细胞置于1.5 mL离心管中，113g（约1000rpm）离心5分钟尽可能弃掉培养基，在细胞沉淀中加500μl PBS溶液轻微振荡重悬，16260g（约12000rpm）离心2分钟尽可能将上清弃净。
注意：
此步骤结束后需立即进行下一步，如果时间不允许需将样品置于-20℃及以下保存。
b、PCR模版制备
加入50μl Cell Extraction Buffer，置于PCR仪中60℃热处理30分钟，98℃热处理2分钟后用作PCR模版。
注意：
制备好的样品-20℃及以下保存时间不要超过1个月，避免反复冻融。
c、阴性对照
样品：50μl Cell Extraction Buffer，提取步骤同上样品处理。
2.PCR：
为了避免污染，此步骤需要对实验环境进行阴性和阳性区间的划分。
a、在阴性区间内制备PCR的反应液
（a）反应孔数=3*待测样品数+3个阴性对照+3个阳性对照
（b）根据反应孔数计算本次所需的PCR MIX总量（含有1孔的损失量）：
PCR MIX=（反应孔数+1）×18μl
（c）各试剂放在冰上或2-8℃条件下融化，并根据表2所示配制PCR MIX：
| Component | Volume | |
| DNA Primers Mix | Homo Sapiens | 1μl |
| Rattus Norvegicus | ||
| Mus Musculus | ||
| PCR Master Mix(2×) | 10μl | |
| Nucleic Acid Free Water | 7μl | |
| 总体积 | 18μl | |
c、加样（不同样品类型加样区域也不同）
将PCR MIX充分混匀后按照18μl/管分装至8联管中，然后按表3所示进行加样：
注意：
制备好的样品-20℃及以下保存时间不要超过1个月，避免反复冻融。
| 样品类型 | 加样示例 | 加样区域 |
| 待测样品 | 18μl PCR MIX + 2μl待测样品基因组DNA提取液 | 样品制备区 |
| 阳性对照 | 18μl PCR MIX + 2μl Species Positive Control Templates Mix | 阳性区 |
| 阴性对照 | 18μl PCR MIX + 2μl阴性对照 | 阴性区 |
3.PCR循环：
| 进程 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 1 | 94℃ | 4分钟 | 1 |
| 2 | 94℃ | 30秒 | 35cycles |
| 3 | 60℃ | 30秒 | |
| 4 | 72℃ | 40秒 | |
| 5 | 72℃ | 5分钟 | 1 |
4.凝胶电泳：
反应结束，取10μlPCR产物，使用TBE电泳缓冲液配置2%琼脂糖凝胶，检测PCR结果。
5.结果解读：
通过与阳性对照、阴性对照检测结果比较，确认样品种属，阳性条带大小大为小鼠150bp、大鼠196bp、人228bp。
6.测序引物：
SeqPh（Homo sapiens） TTCGGCGCATGAGCTGGAGTCC
SeqPr（Rattus norvegicus） CGGCCACCCAGAAGTGTACATC
SeqPm（Mus musculus） ATTACAGCCGTACTGCTCCTAT
注意事项
1.试剂在使用前彻底化冻、混匀（混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀）。
2.细胞培养物中含有的青霉素和链霉素等抗生素以及血清不会影响本产品的检测结果。
3.整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。
4.若待测样品扩增子的电泳图出现两条或两条以上的电泳条带，且条带大小能与图中所示3个细胞种属的条带大小对应，则说明该样品存在其他种属污染，其污染种属可凭扩增子的大小推断（小鼠150bp、大鼠196bp、人228bp）。
5.为了结果的可靠性，建议对待检样品进行两次独立重复测试。
6.如果遇见异常情况请联系我司技术支持。
