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实验技术指南

vero细胞培养条件及方法

时间：2022-12-07 11:03:57 点击：12362次

vero非洲绿猴肾细胞背景简介

Vero细胞由日本学者Yasumura和Kawakita两人在1962年正式从非洲绿猴肾脏分离，1964年6月15日B. Simizu将其从千叶大学带到国立健康研究所(NIH)国立过敏及传染病研究所热带病毒实验室时，已传至第93代。

ATCC细胞库vero细胞图片

逸漠细胞库vero细胞图片

vero细胞特点

1)Vero细胞来源方便，明确，易建库及保存，可连续传代，生长速率快

2)Vero细胞遗传性状稳定，具有良好的生物安全性

3)Vero细胞生产的病毒滴度高，并能较好的依附于片状载体/微载体，易于在生物反应器中进行放大，因此Vero细胞被越来越多地用于生产病毒类疫苗，并使用生物反应器工艺取代了传统转瓶工艺来进行生产。

vero细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

试剂：MEM培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素。

vero细胞培养条件

vero细胞培养基：MEM+10%FBS+1%PS

vero细胞传代比例：1:2至1:3，每周 2-3次

vero细胞代次如何确定：如果vero细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存

消化时间：1-3min（视细胞情况而定）

vero细胞培养注意事项

1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养vero细胞，请按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。

2.vero细胞首次传代建议1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿，不是1个T25瓶传2个10cm皿。

vero细胞培养方法

vero细胞复苏步骤

1.将含有1 mL vero猴肾细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀；

2.在1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀；

3.将所有vero猴肾细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）；

4.第二天换液并检查vero细胞密度。

vero细胞传代步骤

如果vero细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

vero细胞冻存方法

待vero细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例;

1.收集vero细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

2.根据vero细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

我们在培养细胞时，通常会出现很多问题，比如细胞状态不好，生长缓慢，贴壁细胞不贴壁等问题。那么这些出现这些问题的原因是什么呢?又有哪些解决办法呢?

Vero细胞用途

1.vero细胞用于检查大肠杆菌毒素。大肠杆菌毒素最初就因此细胞系而被命名为Vero毒素，后来被称为志贺菌素样毒素，因为它与在痢疾志贺菌中分离出来的志贺菌素很相似。

2.作为培养病毒的细胞宿主。比如：测定某种药物对病毒复制速度的影响，检验是否存在狂犬病毒或者为了研究目的培养病毒。

3.作为真核寄生虫的宿主细胞，尤其是锥体虫属。

4.用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，是在限定代次内不致癌的异倍体细胞，WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质。

Vero细胞特性

Vero细胞系是连续的非整倍体细胞。连续细胞系可以经过许多分裂周期而不衰老。非整倍体是指细胞中的染色体数目与通常的不同。Vero 细胞有干扰素分泌缺陷的特点;与其它普通哺乳动物细胞不同，当被病毒感染时，它不能分泌干扰素，但它仍然具有α/β-干扰素的受体，所以对于其它来源的干扰素仍有正常的反应。

vero细胞培养常见问题

vero细胞培养出现小黑点，怎么处理？

消化离心弃上清后，PBS重悬洗洗，750rpm低速离心4分钟，重新铺下，铺回去镜下观察一下是不是干净的

vero细胞生长过慢怎么办？

原因分析

1.更换不同培养基或血清导致。

解决方法：分析新培养基与原培养基的成分，比较新血清与原血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养基。

2.有少量细菌或真菌污染。

解决方法：用含抗生素培养液培养，如发现污染，尽量丢弃培养物。

3.试剂保存不当导致。

解决方法：血清需要保存在-10到-20℃。培养基需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，要在1周内用完。

4.接种细胞起始浓度太低。

解决方法：增加接种细胞起始浓度。

5.细胞已老化。

解决方法：引入新的保种细胞，重新培养。

6.支原体污染。

解决方法：吸取部分培养基，离心得上清，检测支原体。清洁支架和培养箱。可在培养皿里加入支原体去除剂清除，但如发现支原体污染，尽量建议丢弃。

vero细胞培养过程中不贴壁怎么样？

贴壁细胞培养不贴壁原因及解决方法

1.胰酶消化过度导致。

解决方法：缩短胰酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

2.支原体污染。

解决方法：吸取培养2-3的培养基，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

3.培养基pH值过碱（NaHCO3分解）。

解决方法：使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2。

4.细胞老化。

解决方法：购买新的代数较低的细胞。

5.接种细胞起始浓度太低或太高。

解决方法：调节最佳接种细胞浓度。