产品描述
小鼠胃类器官培养基套装（Mouse Gastric Organoid Culture Kit）是一款用于构建、维持培养及传代扩增小鼠胃组织来源类器官的完全培养基。
该产品可以从小鼠胃组织快速生成胃类器官，极大程度维持了来源于体内胃组织的特征，优化了实验步骤，提高类器官构建效率。
产品信息
表 1. 试剂盒组成信息
| 产品货号 | 产品名称 | 产品规格 |
| IMV-NM05LBM | 小鼠胃类器官基础培养基 | 500mL |
| IMV-NM05SBM | 100mL | |
| IMV-NM05L1 | 小鼠胃类器官培养因子B | 10mL |
| IMV-NM05S1 | 1mL | |
| IMV-NM05L2 | 小鼠胃类器官培养因子C | 1mL |
| IMV-NM05S2 | 0.4mL |
小鼠胃类器官完全培养基使用说明
1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；
2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成 10ml 规格；
3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。
注意：分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用；类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。
小鼠胃类器官的建立与传代培养
原代小鼠胃类器官的建立
1.取样：将组织标本转移到 10 cm 培养皿中，培养皿置于冰盒上，加入 10 mL 4℃预冷的含双抗（IMC-601）的 DPBS 溶液，将组织表面的血管、筋膜和脂肪轻取舍弃。
注：如新鲜标本无法立即处理，组织标本应浸泡在组织保存液（IMV-A004）中，冰上运输尽快处理。
2.清洗：将标本使用含双抗（IMC-601）的 DPBS 溶液进行清洗，反复涮洗约 5 - 10 次，涮洗至清洗液澄清，去除清洗液。
3. 消化：加入 30 mL 的 DPBS 溶液中再加入 150 μL 0.5M EDTA，至 EDTA 终浓度为2.5mM。置 4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。
4.清洗：消化完成后，静置待沉淀，弃上清。加入预冷 DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复 2 次以去除 EDTA。
5.重悬：加入 30 mL 预冷的含 1%FBS 的 DPBS，涡旋 30s，取上清 70μm 滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分 1。重复收集 2 次，记为馏分 2 和馏分 3。
6.收集：300g 离心力 4℃离心 3min。
7.计数：弃上清，根据沉淀量使用 DPBS 重悬组织沉淀，取 20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰上。
8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10μL 基质胶悬液包含 100 至 200个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
9.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30 μL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
10.将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固。
11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠胃类器官完全培养基，24 孔板每孔 500μL，避免破坏已凝固结构。
12.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。
13.每 3~4 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠胃类器官应在 3 至 4 天内建成。
小鼠胃类器官的传代培养
1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将胃类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。
2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。
3. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀，37℃条件下消化 1- 3 min，消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀。
4. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。
5. 300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。
6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。
9. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的小鼠胃类器官完全培养基，24 孔板每孔500 μL。
10. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。
