本视频为厦门逸漠生物出品关于hESC细胞培养教程之:hESC细胞复苏,我们对每一步操作都做了演示,以便科研老师更好地理解hESC细胞复苏实验过程。
hESC细胞培养教程之:hESC细胞复苏
一.准备工作
1. 将恒温水浴锅调至37℃预热,提前30 min将DMEM/F12培养基,Immocell hESC完全培养基,Immocell Y-27632(10 mM) 和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中,恢复至室温;
2. 取15 mL离心管,并做上标记;吸取10 mL DMEM/F12 培养基加到离心管中;
3. 取15 mL离心管,并做上标记;吸取4 mL Immocell hESC完全培养基加到离心管中;按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632(10 mM),充分混匀,恢复至室温;
注意:不要在37℃水浴锅中预温培养基
二.hESC细胞复苏
1.从液氮罐中取出待复苏的细胞,转移置于干冰泡沫箱中,取出一支待复苏的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃,2 min内解冻,肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出;75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面,放入生物安全柜;
2.将细胞悬液移至15 mL离心管中,随后逐滴缓慢加入10 mL DMEM/F12,轻柔晃动混匀细胞,160 g离心5 min;
3.离心完后可看到离心管底部有细胞沉淀,将离心好的细胞置于生物安全柜中,吸弃上清,尽量吸尽,但是注意不要吸起细胞沉淀,加入预温的4 mL Y-27632+hESC完全培养基,重悬细胞沉淀,混匀细胞,尽量避免反复吹打,以免细胞团被吹散成单细胞;
4.吸弃预包被6孔板中2孔的Matrigel包被液;将混匀的细胞按照2 mL/孔接种到2孔中;
5.将新接种的细胞在6孔板做上标记,水平十字摇匀三次;显微镜下50%细胞呈4-10个聚集的团块,密度为10%-20%;
6.将培养皿置于37℃ 5% CO2浓度,饱和湿度的培养箱中;再次水平十字摇匀三次,培养18-24小时后,观察到细胞贴壁良好;
7.更换新鲜的hESC完全培养基,之后每天更换;
hESC细胞复苏注意事项
1.培养基一定恢复室温;
2.细胞解冻时应在冰晶未完全消失时及时取出,不能等到细胞融化;
3.离心完的细胞沉淀重悬不可反复吹打;
4.离心后的细胞沉淀会出现不容易吹不散的情况,在吸弃上清液可剩余10-15 μl,用手指轻弹离心管底部,使细胞均匀分散。
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