hPSC 定向诱导三胚层（单层法）实验教程

时间：2023-07-18 16:20:36 点击：456次

hPSCs的培养及内胚层的直接诱导-以IMMOCELL -ESC（H9）细胞系为例

一、准备工作

准备好冷藏的Stem&Easy Planking solution，吸取6ml铺板液，每孔加入500ul，十字摇匀后4度过夜冷藏或者常温放置2小时后使用。

阶段1：

1、取状态良好，汇合度75-80%的ESC经常温的DPBS洗涤1-2次后，用immocell hPSC 温和消化液+RI 消化7-8分钟后，用1ml hPSC完全培养基终止消化，收集于1.5ml离心管中。

2、取10ul细胞悬液加入台盼蓝，（不用观测）测试细胞活力和数量，汇合度在8成的单个6孔板消化后细胞密度平均为100000，分别加入10ml DE d 抑制剂和20ml hPSC完全培养基+ROCK抑制剂稀释到100000和50000个细胞左右。

3、准备3个用Stem&Easy 即用铺板液铺板的常规12孔板(铺板后需在4度过夜),在不破坏基质的情况下小心吸取5-10孔的上清，尽管体系的不同细胞密度，但是每孔依旧加入2ml细胞悬液。

总的来说，内胚层直接诱导的12孔板中有5孔诱导体系，而20ml稀释的悬液体系有10孔，用于中、外胚层的诱导。

阶段2:中胚层诱导及中、内观察

1、将上述接种好的细胞十字摇匀后，置于常规细胞培养箱。其中内胚层为优化的直接诱导体系，从接种到成熟只要4天，成熟的内胚层谱系细胞排列及其紧密。

2、中、外胚层的诱导体系和hPSC的E8培养体系差异过大，直接诱导细胞容易出现应激而不贴壁，中胚层建议贴壁1D后开始诱导。

3、观察未加诱导液细胞的生长状态和克隆密度，贴壁1天后细胞克隆密度达到30%,可以进行中胚层诱导。吸取上清的hPSC完胚后，用减血清DMEM/F12洗涤一遍后每孔加入1ml的MD differentiation Medium+ROCK抑制剂，中胚层诱导过程会有大量细胞漂浮，为正常现象，约5天后中胚层细胞谱系达到70%的汇合率，细胞形态类似间充质细胞，呈现纤维状。

阶段3:神经外胚层诱导

1、外胚层由神经外胚层、神经嵴（neural crest, NC）、颅基板（cranial placode, CP）和非神经外胚层四种主要的外胚层谱系所组成，每个外胚层谱系诱导方案不同，本方案主要诱导NC外胚层。

2、在hPSC贴壁2天后细胞克隆密度达到60-70%,吸取上清的hPSC培养基，用减血清DMEM/F12洗涤一次后每孔加入2ml的NeuroED differentiation Medium+ROCK抑制剂及10ul的NC 补充液A和10ul的NC补充液B诱导2天向1阶段外胚层谱系诱导。

3、1阶段诱导结束后吸弃上清加入2ml的NeuroED differentiation Medium和8ul的NC补充液A,诱导6-12天，每两天换液一次，6天后外胚层谱系细胞状态呈现神经元细胞状，且每天都有许多细胞漂浮，为正常现象，按时换液即可。

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