hPSCs的培养及内胚层的直接诱导-以IMMOCELL -ESC(H9)细胞系为例
一、准备工作
准备好冷藏的Stem&Easy Planking solution,吸取6ml铺板液,每孔加入500ul,十字摇匀后4度过夜冷藏或者常温放置2小时后使用。
阶段1:
1、取状态良好,汇合度75-80%的ESC经 常温的DPBS洗涤1-2次后,用immocell hPSC 温和消化液+RI 消化7-8分钟后,用1ml hPSC完全培养基终止消化,收集于1.5ml离心管中。
2、取10ul细胞悬液加入台盼蓝,(不用观测)测试细胞活力和数量,汇合度在8成的单个6孔板消化后细胞密度平均为100000,分别加入10ml DE d 抑制剂和20ml hPSC完全培养基+ROCK抑制剂稀释到100000和50000个细胞左右。
3、准备3个用Stem&Easy 即用铺板液铺板的常规12孔板(铺板后需在4度过夜),在不破坏基质的情况下小心吸取5-10孔的上清,尽管体系的不同细胞密度,但是每孔依旧加入2ml细胞悬液。
总的来说,内胚层直接诱导的12孔板中有5孔诱导体系,而20ml稀释的悬液体系有10孔,用于中、外胚层的诱导。
阶段2:中胚层诱导及中、内观察
1、将上述接种好的细胞十字摇匀后,置于常规细胞培养箱。其中内胚层为优化的直接诱导体系,从接种到成熟只要4天,成熟的内胚层谱系细胞排列及其紧密。
2、中、外胚层的诱导体系和hPSC的E8培养体系差异过大,直接诱导细胞容易出现应激而不贴壁,中胚层建议贴壁1D后开始诱导。
3、观察未加诱导液细胞的生长状态和克隆密度,贴壁1天后细胞克隆密度达到30%,可以进行中胚层诱导。吸取上清的hPSC完胚后,用减血清DMEM/F12洗涤一遍后每孔加入1ml的MD differentiation Medium+ROCK抑制剂,中胚层诱导过程会有大量细胞漂浮,为正常现象,约5天后中胚层细胞谱系达到70%的汇合率,细胞形态类似间充质细胞,呈现纤维状。
阶段3:神经外胚层诱导
1、外胚层由神经外胚层、神经嵴(neural crest, NC)、颅基板(cranial placode, CP)和非神经外胚层四种主要的外胚层谱系所组成,每个外胚层谱系诱导方案不同,本方案主要诱导NC外胚层。
2、在hPSC贴壁2天后细胞克隆密度达到60-70%,吸取上清的hPSC培养基,用减血清DMEM/F12洗涤一次后每孔加入2ml的NeuroED differentiation Medium+ROCK抑制剂及10ul的NC 补充液A和10ul的NC补充液B诱导2天向1阶段外胚层谱系诱导。
3、1阶段诱导结束后吸弃上清加入2ml的NeuroED differentiation Medium和8ul的NC补充液A,诱导6-12天,每两天换液一次,6天后外胚层谱系细胞状态呈现神经元细胞状,且每天都有许多细胞漂浮,为正常现象,按时换液即可。
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