背景介绍
脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞,与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs,其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。
材料准备
脂肪干细胞专用培养基
PBS溶液(IMC-401)
0.25%胰蛋白酶细胞消化液 (IMC-501)
I型胶原酶溶液 (1 mg/mL)
实验步骤
1. 3天龄到4周龄(推荐周龄小)大鼠或小鼠1只,麻醉处死,75%乙醇浸泡消毒3-5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤,暴露腹股沟脂肪垫。
2. 钝性剥离脂肪组织,清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎,转移至15 mL离心管中。
3.加入3-4倍体积的0.1%(1 mg/ml) I型胶原酶溶液,37℃水浴振荡约20 min,直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织,辅助消化。
4.250×g,4℃,离心10min。注意离心机预冷至4℃。
5.小心吸去上层油脂,注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基,重悬沉淀,过40μM细胞筛到新的离心管中,再次离心10min。
6.重复洗涤一次,吸去上清。
7.加入8 mL完全培养基重悬沉淀,转移至培养皿中,置于37℃,5% CO2培养箱中。
8.待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。
9.换液时通过弃去培养基,从而去除未贴壁的细胞。
10.以后每两天更换一次培养基,细胞汇合达80%-90%时,0.25%胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例首次传代。
注意事项
1. 全程无菌操作,小鼠要提前酒精浸泡防止污染,仔细剥离去除血管和筋膜组织。
2. 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨,以免破坏细胞。
3. 小鼠皮下脂肪前体细胞随着小鼠周龄增大,诱导分化潜能逐渐下降,故建议选择4周内小鼠进行实验。
4. 剪开皮肤的剪刀需与取材的剪刀相区分,避免污染。
5. 需要的胶原酶量和消化时间需要根据具体情况相应增减。如果消化已经完全,未见明显组织则可停⽌消化。
6. 消化完后的组织在离心前把离心机预冷,脂肪原代细胞在低温既可保持良好的活力,又能便于细胞更好的与油脂分离。
大鼠小鼠脂肪干细胞鉴定
1. 形态学观察
原代培养后,传代2-3次,ADSCs呈现单层,梭状或多枝状的细胞形态,其直径在25-30um,待细胞达到汇合时,它们形态上呈纺锤形,类似于成纤维细胞,贴壁较牢固。
2. 标记物检测
一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性(>90%);CD34、CD45、CD11b为阴性(<5%)。
3. 诱导分化实验
在特定的诱导条件下,脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。
大家都在看
-
细胞冻存步骤视频操作:1.将细胞培养皿放入超净工作台,吸去上清,沿皿壁加入5ml PBS,轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS吸去;2.加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落,可轻拍使未脱落细胞脱落加入3m···...
阅读详情 -
贴壁细胞传代培养视频步骤:1:将细胞培养皿放入超净工作台中,吸去上清,沿血壁加入5ml PBS;2:轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS弃去;3:加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落;4:加入3ml完全培养基终···...
阅读详情 -
细胞复苏视频步骤:1.从液氮罐中迅速取出冻存管,立即放入37°C水浴箱中;2.轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻,最好在1min内完成;3.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min;4.取4mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养皿上···...
阅读详情 -
T25瓶细胞运输收货视频处理:1.吸出运输用培养基,加入5m」1xPBS清洗1遍,去掉PBS,加入2m1胰酶消化,并放入培养箱孵育1-2min;2.在显微镜下观察细胞是否脱落,加入3mI完全培养基终止消化,轻轻吹打细胞,使其脱离瓶壁3.细胞悬···...
阅读详情 -
冻存细胞运输收货处理视频操作步骤:1.提前打开水浴锅设置37C,将取出的冻存管迅速放入37C水浴锅中,轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻2.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min3.取3mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养···...
阅读详情 -
第四课:重编程人的内皮细胞至造血干细胞需要血管的诱导视频:在本篇研究中,作者发现一套转录因子的组合能够使人的脐带内皮细胞和成人真皮微血管内皮细胞转化为具有多功能干性的造血细胞,内皮细胞的诱导需要无血清血管···...
阅读详情
相关问答
-
细胞增殖速度怎么变得这么慢了?细胞发生病变,出现细胞变圆、从培养瓶壁脱落又是什么情况?要疯了,培养细胞怎么就这么难呢~实验过程中存在的“幽灵”,即使是经验丰富的老研究员也不得不面对,没错,它就是支原体感···...
阅读详情 -
胎牛血清和小牛血清的差别在哪里? 胎牛血清和小牛血清的差别在哪里? 胎牛血清(FBS) :从八月龄胎牛心脏穿刺取血。适用于专业的研究和试验,包括干细胞研究、免疫分析和抗体生产。 新生牛血青/小牛血清(NBCS) :从自出···...
阅读详情 -
适合细胞长期保存的温度是多少? 适合细胞长期保存的温度是多少? 细胞长期保存温度是-130°C或更低。液氮罐中气态层温度在-140°C至-180°C之间细胞可保存在气态层或浸入液氮中,如果可以最好保存在气态层,因为这样···...
阅读详情 -
如何在细胞铺板时避免“边缘效应”? 如何在细胞铺板时避免“边缘效应”? 以下这三点一定要注意!细胞实验铺板时,为避免“边缘效应”,以应用96孔板的中间60孔为最佳,一般四周的一圈边缘孔不养细胞,只做空白或阴性···...
阅读详情 -
如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候?如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候?用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满90%的时候,这时细胞生长状态好,细胞数量也多并且在收获细胞前24小时换一次培养液。收获用来冻···...
阅读详情 -
培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用?培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用?几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以各种培养液中都含有较大量的谷···...
阅读详情