背景简介
二十世纪七十年代，Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞，呈梭形，可以进行体外克隆和多向分化，被称为CFU-Fs(colony-forming unit fibro-blasts)。随后，这种骨髓来源的基质细胞被进一步发现是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞，因其具有干细胞的部分特性，而被命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。
BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。
目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。
利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs;而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。
对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。
准备工作
1. 6孔板，移液器，巴式管，1ml注射器，细胞培养箱，超净工作台，低速离心机，4℃冰箱，-80℃冰箱，细胞冻存管，T25细胞培养瓶，眼科剪，尖头镊
2. 分离BMSC所需的试剂有逸漠生物间充质干细胞基础培养基，逸漠生物胎牛血清，DMSO，双抗，逸漠生物PBS , 逸漠生物0.25%胰酶，逸漠生物无血清细胞冻存液，
分离过程
1. 以颈椎脱臼法处死SPF级出生1-3D(最大也可至4周龄)C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。
2. 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含双抗的PBS溶液清洗三遍。
3. 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。
4. 用注射器以PBS反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。
5. 收集骨髓液，过40μM细胞筛。
6. 收集过滤骨髓液，离心，后加入培养基接种于培养基皿中置于37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。
7. 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。
注意事项
1. 全程无菌操作，鼠要提前酒精浸泡防止污染，仔细剥离去除血管和筋膜组织。
2. 剪开皮肤的剪刀需与取材的剪刀相区分，避免污染。
大鼠/小鼠骨髓间充质干细胞鉴定
1. 形态学观察
原代培养后，传代2-3次，BMSCs呈现单层，梭状或多枝状的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞，贴壁较牢固。
2. 标记物检测
一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性(>90%);CD34、CD45、CD11b为阴性(<5%)。
3. 诱导分化实验
在特定的诱导条件下，脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。
大家都在看
-
细胞冻存步骤视频操作:1.将细胞培养皿放入超净工作台,吸去上清,沿皿壁加入5ml PBS,轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS吸去;2.加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落,可轻拍使未脱落细胞脱落加入3m···...
阅读详情 -
贴壁细胞传代培养视频步骤:1:将细胞培养皿放入超净工作台中,吸去上清,沿血壁加入5ml PBS;2:轻洗细胞表面,洗去表面培养基,再将PBS弃去;3:加入2ml胰酶,37℃消化1-2分钟,显微镜下观察细胞是否脱落;4:加入3ml完全培养基终···...
阅读详情 -
细胞复苏视频步骤:1.从液氮罐中迅速取出冻存管,立即放入37°C水浴箱中;2.轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻,最好在1min内完成;3.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min;4.取4mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养皿上···...
阅读详情 -
T25瓶细胞运输收货视频处理:1.吸出运输用培养基,加入5m」1xPBS清洗1遍,去掉PBS,加入2m1胰酶消化,并放入培养箱孵育1-2min;2.在显微镜下观察细胞是否脱落,加入3mI完全培养基终止消化,轻轻吹打细胞,使其脱离瓶壁3.细胞悬···...
阅读详情 -
冻存细胞运输收货处理视频操作步骤:1.提前打开水浴锅设置37C,将取出的冻存管迅速放入37C水浴锅中,轻轻摇晃,使细胞快速融化解冻2.将冻存管移入离心机中1000rpm离心3min3.取3mL完全培养基到一个新的6cm培养皿中,在培养···...
阅读详情 -
第四课:重编程人的内皮细胞至造血干细胞需要血管的诱导视频:在本篇研究中,作者发现一套转录因子的组合能够使人的脐带内皮细胞和成人真皮微血管内皮细胞转化为具有多功能干性的造血细胞,内皮细胞的诱导需要无血清血管···...
阅读详情
相关问答
-
细胞增殖速度怎么变得这么慢了？细胞发生病变，出现细胞变圆、从培养瓶壁脱落又是什么情况？要疯了，培养细胞怎么就这么难呢~实验过程中存在的“幽灵”，即使是经验丰富的老研究员也不得不面对，没错，它就是支原体感···...
阅读详情 -
胎牛血清和小牛血清的差别在哪里？ 胎牛血清和小牛血清的差别在哪里？ 胎牛血清(FBS) :从八月龄胎牛心脏穿刺取血。适用于专业的研究和试验，包括干细胞研究、免疫分析和抗体生产。 新生牛血青/小牛血清(NBCS) :从自出···...
阅读详情 -
适合细胞长期保存的温度是多少？ 适合细胞长期保存的温度是多少？ 细胞长期保存温度是-130°C或更低。液氮罐中气态层温度在-140°C至-180°C之间细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可以最好保存在气态层，因为这样···...
阅读详情 -
如何在细胞铺板时避免“边缘效应”？ 如何在细胞铺板时避免“边缘效应”？ 以下这三点一定要注意!细胞实验铺板时，为避免“边缘效应”,以应用96孔板的中间60孔为最佳，一般四周的一圈边缘孔不养细胞，只做空白或阴性···...
阅读详情 -
如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候？如何收获需要冻存的细胞?最佳是什么时候？用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满90%的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多并且在收获细胞前24小时换一次培养液。收获用来冻···...
阅读详情 -
培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用？培养基中谷氨酰胺究竟有什么作用？几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以各种培养液中都含有较大量的谷···...
阅读详情
