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实验技术指南

来自CX43野生型和基因敲除小鼠的永生化小鼠皮质星形胶质细胞的构建和鉴定

时间：2022-10-17 09:43:12 点击：1251次

写在前面

今天推荐的是由美国阿尔伯特爱因斯坦医学院在2021年发表于Frontiers in Cellular Neuroscience (2021 IF 6.147, JCR/Q1)的一篇文章，通讯作者是Mia M. Thi 教授and Marcia Urban-Maldonado教授。

文章摘要

我们用编码 hTERT 的慢病毒载体转导了从四窝胚胎野生型 (WT) 和无connexin 43 (Cx43) 小鼠幼崽培养的小鼠皮质星形胶质细胞，并测量了星形胶质细胞特异性标志物的表达直至第 10 代 (p10)。由此产生的永生化细胞系(分别称为 IWCA 和 IKOCA)表达的生物标志物与新生小鼠星形胶质细胞的生物标志物一致，包括来自野生型但不来自 Cx43 缺失小鼠的 Cx43、缺乏 Cx30 和存在 Cx26。 AQP4 是在星形胶质细胞端足中发现的高丰度水通道，在早期传代中表达水平适中，其 mRNA 和蛋白质下降至低水平，但 p10 仍可检测到。星形胶质细胞生物标志物醛脱氢酶 1L1 (ALDH1L1)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 的 mRNA 水平在连续传代期间保持相对恒定。 GS 蛋白表达得以维持，而 GFAP 随着细胞传代而下降，但在 p10 时仍可检测到。谷氨酸转运蛋白 1 (GLT-1) 的 mRNA 和蛋白质水平均随传代次数而下降。相应时间的免疫染色与蛋白质印迹的数据一致，并提供了这些蛋白质在适当的细胞内位置表达的证据。与我们生成 Cx43 功能性表达或缺失的永生化细胞系的目标一致，发现 IWCA 细胞在细胞间染料转移方面耦合良好，并且在连接形成的时间过程、电耦合方面与原代星形胶质细胞培养相似强度和电压灵敏度。此外，在 IWCA 细胞系与 bEnd.3 微血管内皮细胞的共培养中，屏障功能得到了增强。此外，免疫染色显示 IWCA 中的扁平内源性 Cx43 间隙连接斑块在外观上与用荧光蛋白标记的 Cx43 转染 IKOCA 细胞后获得的斑块相似。 IKOCA 细胞中 Cx43 的重新表达允许对连接蛋白进行实验操作和实时成像之间的相互作用连接蛋白和其他蛋白质。我们得出结论，这些细胞系的特性类似于原代培养的星形胶质细胞，它们可以通过在适合星形胶质细胞的细胞环境中促进遗传和药理学操作，为功能研究提供有用的工具。

研究背景

脊椎动物间隙连接 (GJ) 由连接蛋白家族形成。 GJ 通道在相邻细胞之间提供载流离子、代谢底物和信号分子的直接胞质交换。最广泛和最丰富的 GJ 蛋白是连接蛋白 43 (Cx43)，它是大脑中心肌细胞、脉管系统和星形胶质细胞之间的主要 GJ 蛋白。通过 Cx43 GJs 进行的细胞间通讯在其表达的组织中介导关键的基本功能，包括整个心脏的收缩传播、神经前体细胞迁移过程中的信号传导以及通讯隔间中细胞功能的协调。因为它是一种丰富的 GJ 蛋白，所以当第一只 Cx43-null 小鼠产生时，纯合的无效幼崽在出生后不久就死亡也就不足为奇了(Reaume 等，1995)。令人惊讶的是，围产期死亡率不是整个心脏节律传播紊乱的结果，而是由于延迟的神经嵴细胞迁移和随后的左心室流出道发育缺陷(Lo和Wessels，1998)。因此，Cx43-null 小鼠左右心室之间的卵圆孔在出生时不会关闭。因此，Cx43-null 小鼠存活到胎盘循环结束，此时动物不再充分灌注。为了研究缺乏 Cx43 表达的细胞的特性，我们维持了 Cx43 杂合子的繁殖菌落多年，以便我们可以在分娩后立即从野生型和 Cx43-null P0 幼崽或 E19-20 获得组织并制备原代细胞培养物通过剖腹产获得的幼崽(Scemes 等人，1998 年)。该方案成本高昂且效率低下，因为这些转基因小鼠的繁殖是不规则的，并且在验证基因型之前必须从每只小鼠中分别制备细胞培养物。为了避免这些困难，我们投资于产生永生化星形胶质细胞，这对于允许使用具有和不具有 Cx43 表达的培养星形胶质细胞以获得更高的传代次数非常有益，并符合缩写：ALDH1L1，10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶; DiI, 1,1-dioctadecyl-3,3,33-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; AQP4，水通道蛋白4; bEnd.3 细胞，来自小鼠 ATCC R CRL-2299TM 的脑微血管内皮细胞系; Cx43，连接蛋白43; Cx30，连接蛋白30; Cx26，连接蛋白26; EBFP2，增强型蓝色荧光蛋白 2，FRAP，光漂白后的荧光恢复; GS，谷氨酰胺合成酶; GFAP，胶质酸性纤维蛋白; GJ、GLT-1 (EAAT2)、谷氨酸转运蛋白 1(兴奋性氨基酸转运蛋白 2)：间隙连接; hTERT，人类端粒酶逆转录酶; IWCA，永生化的野生型皮质星形胶质细胞; IKOCA，永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞; msfGFP，单体化超级文件夹绿色荧光蛋白; qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应; sfGFP，超级文件夹绿色荧光蛋白。细胞神经科学前沿| www.frontiersin.org 2 用于实验动物模型的三个“R”(减少动物数量、优化技术以最大程度地减少疼痛以及在可能的情况下替换动物实验)，同时节省时间、金钱并减少实验室材料浪费。我们用 hTERT 转导了来自 Cx43-null 和野生型同窝小鼠的皮质星形胶质细胞的原代培养物。如我们之前所述(Thi 等人，2010)，该方法已成功用于生成其他细胞系，包括野生型和 Cx43-null 成骨细胞系。此外，据报道，hTERT 转导与癌基因转染相比具有优势，因为它不涉及肿瘤抑制基因的失活(Lee 等，2004)。在这份手稿中，我们报告了源自野生型和 Cx43-null 小鼠的 hTERTimmortalized 星形胶质细胞系的特征，命名为 IWCA 和永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞 (IKOCA) 细胞，关于星形胶质细胞特异性 mRNA 和蛋白质的表达以及几个不同的功能特性。我们还证明了在 IKOCA 细胞中外源表达的由 Cx43 形成的 GJ 斑块在外观上与在野生型原代星形胶质细胞培养物中表达的 GJ 斑块相似，表明这些细胞系可用于研究细胞和分子操作对星形胶质细胞结构的影响和功能。

研究内容

1.WT 和 Cx43-Null 星形胶质细胞原代培养物中星形胶质细胞标志物表达水平的量化，以及用 hTERT 转染每种基因型后的通道

在 IWCA 星形胶质细胞中发现 Cx43 转录物表达随着时间的推移相对恒定，并且在 IKOCA 空值中根本无法检测到(图 1A)。 Cx30 水平太低，无法在所有通道的两种基因型中量化(图 1B)，而 Cx26 丰度在两种基因型中相对恒定，直至第 10 代(图 1C)。水通道蛋白 4 (AQP4) mRNA 表现出类似的持续表达，尽管不同细胞系中的水平差异很大(图 1D)。我们检查的其他星形胶质细胞标志物包括谷氨酰胺合成酶 (GS)、醛脱氢酶 1(10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶，ALDH1L1)、谷氨酸转运蛋白 1 [GLT-1、人兴奋性氨基酸转运蛋白 2 (EAAT2) 的小鼠直系同源物，也称为溶质载体家族 1 成员 2 (SLC1A2)] 和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)。 GS、ALDH1L1 和 GFAP 随着时间的推移，在两种基因型的培养中，发现其 mRNA 表达水平几乎恒定(图 1E、F、H)。 GLT-1 的表达存在于两种基因型的两个细胞系中，而在其他 2 个细胞系中低于检测(图 1G)。

进行蛋白质印迹和免疫染色以量化蛋白质表达水平并确定 IWCA 和 IKOCA 在第 1-10 段的细胞定位。图 2A-C 中显示了代表性通道中 Cx43 的免疫印迹和免疫染色，图 2A-D 中显示了 AQP4。在 IWCA 培养物中，Cx43 蛋白水平直到第 5 代才显着降低，但在第 10 代降低到其初始水平的约 30%(图 2C)。在免疫染色培养物或从 IKOCA 获得的免疫印迹中的任何时间点都未检测到 Cx43。免疫染色和蛋白质印迹均显示 IKOCA 中的 AQP4 蛋白水平在第 1 代时低于 IWCA 星形胶质细胞，并且从第 1 代开始两种基因型的 AQP4 蛋白水平逐渐下降;在第 5 代及以后，基础 AQP4 表达非常低(图 2D)。还确定了 GFAP 和 GS(其他两种特征性星形胶质细胞标志物)的表达水平和细胞定位。与图 1 所示的 mRNA 结果相似，在所有通道的 IWCA 和 IKOCA 中均可检测到 GFAP 染色(图 3A、B)，但蛋白质水平随时间下降(图 3C)。然而，IKOCA 中 GFAP 蛋白表达的下降比 IWCA 更快，正如 im 所揭示的，在两种基因型的培养中，随着时间的推移，mRNA 表达水平几乎恒定(图 1E、F、H)。 GLT-1 的表达存在于两种基因型的两个细胞系中，而在其他 2 个细胞系中低于检测(图 1G)。进行蛋白质印迹和免疫染色以量化蛋白质表达水平并确定 IWCA 和 IKOCA 在第 1-10 段的细胞定位。图 2A-C 中显示了代表性通道中 Cx43 的免疫印迹和免疫染色，图 2A-D 中显示了 AQP4。在 IWCA 培养物中，Cx43 蛋白水平直到第 5 代才显着降低，但在第 10 代降低到其初始水平的约 30%(图 2C)。在免疫染色培养物或从 IKOCA 获得的免疫印迹中的任何时间点都未检测到 Cx43。免疫染色和蛋白质印迹均显示 IKOCA 中的 AQP4 蛋白水平在第 1 代时低于 IWCA 星形胶质细胞，并且从第 1 代开始两种基因型的 AQP4 蛋白水平逐渐下降;在第 5 代及以后，基础 AQP4 表达非常低(图 2D)。

还确定了 GFAP 和 GS(其他两种特征性星形胶质细胞标志物)的表达水平和细胞定位。与图 1 所示的 mRNA 结果相似，在所有通道的 IWCA 和 IKOCA 中均可检测到 GFAP 染色(图 3A、B)，但蛋白质水平随时间下降(图 3C)。然而，免疫印迹显示，IKOCA 中 GFAP 蛋白表达的下降比 IWCA 更快(图 3C)。 GS 在 IWCA 和 IKOCA 中显示出强烈的免疫染色，直到第 10 代(图 3A，B)。西方免疫印迹检测到 IWCA 和 IKOCA 培养物中的 GS 明显增加，直到第 5 代，此后下降(图 3D)。方差很大，通过 ANOVA 评估，基因型之间或随时间的差异并不显着。

定量 RT-PCR 显示转导后 10 次传代期间编码星形胶质细胞蛋白的 mRNA 的表达水平图

Fig. 1. 图 1 |定量 RT-PCR 显示转导后 10 次传代期间编码星形胶质细胞蛋白的 mRNA 的表达水平。永生化野生型 (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮质星形胶质细胞系中星形胶质细胞生物标志物的表达水平。在用 hTERT 转导后最多 10 代的每个时间点测量的表达水平被标准化为转导前 IWCA 星形胶质细胞的表达水平(在直方图中标记为第 1 代)。直方图中的点对应于单个细胞系和条形，方差对应于为两种基因型中的每一种生成的四个独立克隆的平均值 ± SE 值。 (A) Cx43 水平在 IWCA 中稳定多达 10 代，而在所有 IKOCA 系中均不存在 Cx43 表达。 (B) 在永生化之前或之后的任何时间点，在 IWCA 或 IKOCA 中均未检测到 Cx30。 (C) Cx26 存在于 IWCA 和 IKOCA 中，并且在两种基因型中都相对稳定，并持续传代。 (D) IWCA 和 IKOCA 中 AQP4 转录物的水平，第 10 代的最低水平约为原代细胞的 20%。 (E,F) 星形胶质细胞标志物谷氨酰胺合成酶 (GS) 和醛脱氢酶 (ALDH1L1) 的转录水平在检查的 10 代中非常稳定。 (G) 谷氨酸转运蛋白 (GLT1) 的 mRNA 低于原代细胞，但基因型之间相似，并且在两种基因型的第 5 代后下降，在第 10 代达到不可检测的水平。(H) 星形胶质细胞中间丝转录物 GFAP 的水平是稳定的在两种基因型中，但在第 10 代的两种 IKOCA 细胞系中含量较低。

图2. 在前十代中，Cx43 和 AQP4 在 IWCA 和 IKOCA 中的表达水平和定位。 (A,B) 永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮质星形胶质细胞培养物中 Cx43 的免疫染色显示 IWCA 中的点状细胞间定位不太丰富，但随着时间的推移在培养中仍然很突出。 IKOCA 在任何时间点均未显示 Cx43 免疫染色。 AQP4 的点状分布表明该蛋白在 IWCA 和 IKOCA 中的第 10 代仍然很好地表达，但降低到非常低的水平。注意：细胞核染色中的点状染色是非特异性的，可能是 AQP4-C19 抗体的伪影，如前所述 (Thi et al., 2008)。比例尺为 20 µm，图中所有显微镜图像的比例相同。 (C) 蛋白质印迹显示 IWCA 中的 Cx43 蛋白水平在第 10 代之前没有显着下降，当时其水平降低到原代星形胶质细胞的 30% 左右。 IKOCA 在所有时间点均不存在 Cx43 蛋白表达。 (D) AQP4 蛋白表达非常低，但在第 5 代及以上两种基因型中均可检测到。

前十代中 GFAP 和 GS 在 IWCA 和 IKOCA 中的表达水平和定位图

图 3 |前十代中 GFAP 和 GS 在 IWCA 和 IKOCA 中的表达水平和定位。 (A,B) IWCA 和 IKOCA 的 GFAP 免疫染色随着时间的推移而下降。 GS 在所有传代的 IWCA 和 IKOCA 培养物中均高度表达，但在两种基因型中的第 5 代均下降。比例尺为 20 µm，图中所有显微镜图像的比例相同。 (C) GFAP 蛋白水平也随着逐步传代迅速下降，IWCA 中的最低水平约为 27%，IKOCA 培养中约为 2%。 (D) GS 蛋白水平在培养中随着时间的推移而增加，在所有时间点都有些变化。

2. 永生化皮质星形胶质细胞系中 Cx43 功能的评估

我们的永生化程序的主要目标是获得正常星形胶质细胞和缺乏主要 GJ 蛋白 Cx43 表达的星形胶质细胞，这将为评估 Cx43 在星形胶质细胞行为的多个方面的作用提供一个理想的工具。为了确保功能性 Cx43 表达在永生化星形胶质细胞中持续多次传代，我们测量了小荧光染料 LY (MW 444 Da) 和钙黄绿素 (MW 622 Da) 的细胞间转移。为了量化与 LY 的耦合强度，我们在融合培养皿中注入了单个细胞。如图 4A 所示，在第 9-10 代 LY 转移在 IWCA 之间很常见，从注入的细胞扩散到其相邻细胞的 13.7 ± 2.8%(图 4C)，每个字段总共有 535 ± 100 个细胞。 IKOCA 培养物中的 LY 转移几乎不存在(图 4B)，从注入的细胞扩散到仅 1.0 ± 0.1% 的相邻细胞(图 4C)，每个字段总共有 102 ± 27 个细胞。染料转移也使用所谓的“降落伞试验”进行了评估。在本次检测中，将载有 GJ 可渗透染料钙黄绿素和亲脂性 GJ 不可渗透膜染料 DiI 的第 7-10 代分离供体细胞逐滴添加到第 7-10 代受体细胞的单层上。在添加供体细胞后 1-2 小时观察到偶联。如图 4D、G 所示，每个供体 IWCA 细胞在 IWCA 受体培养物中平均招募了 24.36 ± 8.95 个相邻细胞，证实了 LY 注射试验的结果，证明 IWCA 在功能上是耦合的。未观察到 IWCA 和 IKOCA 之间的异细胞偶联(图 4E，G)，并且 Cx43 缺陷型 IKOCA 未显示同细胞偶联(图 4F，G)。

使用全细胞电压钳方法的电生理记录提供了测量 GJ 介导的耦合的最灵敏和定量的方法，因此揭示的生物物理特性可以指示哪些连接蛋白形成通道(del Corsso 等人，2006)。来自 IWCA(通道 >10)的成对全细胞记录响应长电压脉冲显示，当任一极性的电压较低时，结电流随时间保持恒定，但在电压脉冲高于约 ±40 mV 时电流下降(图 4H)。结电导的这种微弱但明显的电压敏感性与在用 Cx43 转染的细胞系中测量的相似(Moreno 等，1995)。在 IKOCA(通道 >10)中，耦合的细胞对较少，连接电导低得多(图 4I)。在 IWCA 中计算的结电导在 17 个细胞对中为 17.5 + 3.2 nS，而在 23 个 IKOCA 细胞对中为 0.36 + 0.18 nS，差异显着(p < 0.0001)。

染料偶联和电生理研究的结果表明 IWCA 保留了形成功能性 Cx43 GJ 通道的能力。在 IKOCA 中，无法形成功能性 Cx43 GJ 预计仅归因于缺乏 Cx43 表达。为了证明组装和形成 Cx43 GJ 所需的细胞机制也保留在 IKOCA 中，我们用 GFP 标记的 Cx43 转染这些细胞，并将 GJ 斑块形成与 IWCA 的形成进行比较。如图 5A 所示，GJ 勾勒出 IWCA 的边缘，但在未转染的 IKOCA 中完全不存在(图 5D)。在 IWCA 中，内源性 Cx43 GJ 斑块在更高放大倍率下观察时似乎由一些离散的较小斑块组成(图 5B，C)。同样，用 GFP 标记的 Cx43 转染的 IKOCA 中的 Cx43 斑块显示为包含圆形亚基的扁圆结构域(图 5E，F)。图 5E 中具有较暗但可检测到的 GFP 信号的细胞区域代表非连接 sfGFP-Cx43，当使用共聚焦显微镜在高放大倍率下以 3D 观察时，可以识别出主要位于质膜上。 Cx43 的总体表达增加和更大的 GJ 斑块结构代表了在 IWCA 星形胶质细胞中发现的外源性连接蛋白和内源性表达的 Cx43 的显着差异。这些结果表明，Cx43-null 星形胶质细胞的永生化不会损害这些细胞形成 GJ 的能力，并且转染 GFP 标记的 Cx43 的 IKOCA 中 GJ 斑块的组织类似于 IWCA 之间内源性表达的 GJ 斑块。最重要的是，这个发现表明 IKOCA 细胞系可能是一种有用的底物，其中 Cx43 GJ 及其变体可以在星形胶质细胞背景中表达，以模拟正常细胞环境为了研究 Cx43 变体表达对细胞生理学和形态学的影响，不存在内源性 Cx43 表达的混淆。

在融合的皮质星形胶质细胞培养物中评估永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 中的功能 GJ 耦合图

图 4 |在融合的皮质星形胶质细胞培养物中评估永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 中的功能 GJ 耦合。 (A) 在第 10 段观察到的 IWCA 之间的荧光黄 (LY) 染料耦合。左，明亮的视场相衬图像，带有叠加的荧光。正确的；带有星号的荧光图像，表示微量注射 LY 的细胞;注意在所有直接相邻的邻居中检测到间隙连接介导的染料扩散。比例尺 = 40 µm (B)。在第 10 段 IKOCA 之间未观察到 LY 染料偶联。左侧，亮相加荧光显示注射视野。右图：在 IKOCA 培养物中，染料不会从注入的细胞扩散到相邻的相邻细胞中。比例尺 = 40 µm (C)。 LY 染料在 IWCA 和 IKOCA 培养物中扩散的量化。直方图对应于每个基因型在第 10 代时在每个基因型的两个独立培养物中进行的六次注射的平均值 ± SEM (∗∗∗∗p < 0.001)。 (D-F)。降落伞试验：(D)从 IWCA 第 9 代供体到受体 IWCA 细胞(IWCA-IWCA); (E) 从 IWCA 供体到受体 IKOCA 第 10 代细胞 (IWCA-IKOCA)，和 (F) 从 IKOCA 第 10 代供体到受体 IKOCA 细胞。通过双钙黄绿素-DiI(分别为绿色和红色)标记识别供体细胞。比例尺 = 20 µm (G) 钙黄绿素染料在 IWCA-IWCA、IWCA-IKOCA 和 IKOCA-IKOCA 供体-受体培养物中的定量。偶联被评估为每个供体细胞的偶联细胞数。 (H) 使用 IWCA 和 IKOCA 电池对之间的双全电池电压钳测量的结电流。缓慢的电压斜坡(插图，–100 mV 到 +100 mV 超过 5 s)被传送到单元 1，同时记录单元 1(I1，上迹线)和单元 2 中的电流(在单元 2 中记录电流，同时向单元 1 提供电压与结电流等效，但极性相反，标记为 Ij)。来自 IWCA 对(左下轨迹)的结电流很大，并且显示出与 Cx43 通道的电压依赖性一致的电压非线性。 IKOCA 对的结电流非常小，表明细胞没有高度耦合。 (I) IWCA 和 IKOCA 电池对中结电导 (gj = Ij/V) 的量化。请注意，与 IKOCA 相比，WCA 中的 gj 明显更强(17.35 + 3.2 nS，N = 17 vs 0.36 + 0.18 nS，N = 23;p < 0.0001)。

永生化 WT 皮质星形胶质细胞 (IWCA) 中的内源性 Cx43 GJ 斑块与永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞 (IKOCA) 中由 GFP 标记的 Cx43 形成的 GJ 斑块的比较图

图 5 |永生化 WT 皮质星形胶质细胞 (IWCA) 中的内源性 Cx43 GJ 斑块与永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞 (IKOCA) 中由 GFP 标记的 Cx43 形成的 GJ 斑块的比较。 (A, B) GJ 斑块 (箭头) 勾勒出单个 IWCA (由 DAPI 染色的细胞核识别)。比例尺 = 20 µm。 (C) 在更高的放大倍数下，这些连接区域看起来有点扁，由紧密堆积的斑块形成。比例尺 = 5 µm。 (D) 在 IKOCAs 中，内源性 Cx43 连接不存在。 (E) 用 GFP 标记的 Cx43 转染 IKOCA 细胞诱导形成标记的间隙连接斑块。比例尺 = 20 µm。 (F) 来自“E”的更高放大率图像。比例尺 = 5 µm。

3. IKOCA 细胞允许对间隙连接斑块形态和与其他细胞器的相互作用进行超分辨率成像

使用 Zeiss 980 Airyscan2 显微镜对连接两个 IKOCA 细胞的 EBFP2-Cx43(图 6 中免疫染色的绿色)囊泡(绿色斑点)和 GJ 斑块的位置进行成像，以检查 GJ 斑块形态特征，例如不连续性和小的相邻 GJ 斑块(放大插图在图 6A)。请注意图 6A 中所示 GJ 斑块边缘附近的明亮小斑点，其中的形态让人想起之前通过电子显微镜和其他人在转化细胞系中观察到的萌芽内吞 GJ(Bell 等人， 2018)。 GJs 与线粒体以及与其他细胞器之间的相互作用改变了细胞间的通讯(Wang 等人，2013;Kang 等人，2014)。如图 6 所示，培养物中某些 IKOCA 细胞中 Cx43 的重新表达允许比较 IKOCA 细胞中 Cx43 表达对线粒体位置和形态的影响。在这里，我们显示所有线粒体的后固定免疫荧光染色。注意线粒体明显定位于 EBFP2-Cx43 斑块区域(图 6C 显示反射性 Cx43 GJ 斑块，白色箭头)，该斑块部分正在进行内吞作用，小线粒体可能位于 GJ 斑块的大内吞部分(GJ 内体也已知作为连接体)。连接体相关的线粒体在图 6D 中用黄色箭头表示。星形胶质细胞膜折叠但未被 GJ 斑块占据的区域由图 6C 中小白色箭头旁边的微弱但增强的绿色信号指示。这些数字突出了 IKOCA 和 IWCA 星形胶质细胞在高分辨率成像中的实用性。

IWCA 和 IKOCA 细胞可用于通过超分辨率显微镜研究 GJ 形态和与其他蛋白质的相互作用图

图 6 | IWCA 和 IKOCA 细胞可用于通过超分辨率显微镜研究 GJ 形态和与其他蛋白质的相互作用。 (A) 当两个转染细胞接触时，IKOCA 第 10 代细胞转染以重新表达 Cx43，并带有荧光蛋白标签(绿色，用针对 Cx43 的抗体进行免疫标记)形成 GJ。如蓝色 DAPI 染色所示，在 A 中图像的场中心有未转染的细胞与两个转染的 IKOCA 细胞接触，它们不表达 Cx43 并且不形成 GJ(比例尺 = 20 µm)。超分辨率成像可以深入了解 GJ 斑块和内吞 GJ 斑块的结构特征，如放大插图(比例尺 = 2 µm)所示。 (B) 在 IKOCA 细胞亚群中重新表达标记为 Cx43 的荧光蛋白，随后对所有 IKOCA 细胞(例如线粒体)中存在的次级细胞特征进行免疫染色，从而可以研究 Cx43 表达在星形胶质细胞样细胞中的影响。细胞培养样品 - 使用超分辨率显微镜(比例尺 = 20 µm)促进 Cx43 和其他细胞器之间相互作用的并排比较和可视化。 (C) 放大 Cx43 GJ 斑块结构(绿色，用白色箭头表示)似乎与小线粒体相互作用的位置(用 TOMM20 染色表示，洋红色)。该 GJ 斑块代表反射性 GJ 斑块，该斑块已在同一星形胶质细胞的质膜重叠处形成，从而允许 GJ 形成。 (D) 与“C”中相同区域的视图。移除 Cx43 通道以允许观察内吞 Cx43 连接体(黄色箭头)内的 TOMM20 染色 - 提高线粒体转移可能通过 Cx43 内吞作用发生的可能性。 (C，D)中的比例尺 = 2 μm。

4. IKOCA 细胞允许对 GJ 和相互作用蛋白进行光学实验

三维 FRAP(如图 7A 所示)允许改进对 GJ 内斑块蛋白迁移率的评估，因为可在 3D FRAP 中检测到可用于恢复的整个有效(对于此时间尺度)荧光池。其他 GJ 特征的运动，例如当 GJ 的一部分被内吞时形成的不连续性，可以使用共聚焦显微镜在永生化星形胶质细胞中轻松研究。 Cx43 在 GJ 斑块结构中的排列比其他蛋白质(如 Cx30 和 Cx26)更稳定，如先前在转化细胞系中报道的(Stout 等，2015)。培养的 IKOCA 和 IWCA 细胞薄而扁平的形态导致它们产生 GJ 斑块，这些斑块通常与生长基质(盖玻片)几乎平行排列。这些特性使 IKOCA 和 IWCA 细胞成为活体 3D 显微镜和 GJ 和细胞内细胞器的超分辨率成像的理想选择。能够完全替代 IKOCA 细胞中缺失的 Cx43 表达带有荧光蛋白标记的 Cx43 允许在兼容的颜色通道中共表达带有荧光蛋白标记的其他感兴趣的蛋白质。图 7B 显示了一对 IKOCA 细胞的 3D 延时图像的正交最大强度投影，该细胞由正在部分经历的蓝色荧光(伪洋红色)EBFP2-Cx43 GJ 斑块连接内吞作用。细胞与 msfGFP-ATG9A(绿色)共转染。 ATG9A 先前被证明与 Cx43 的内吞过程相互作用并共定位于质膜(Bejarano 等人，2014)，但 ATG9A 阳性的小囊泡样结构明显转移到 Cx43 GJ 斑块的部分。内吞作用起始点(图 7B，放大插图)以前没有报道过，并且在没有 IKOCA 细胞的情况下很难在星形胶质细胞样细胞中观察到。

IKOCA 细胞中修饰的 Cx43 转基因的表达可以在没有内源 Cx43 表达的混杂影响的情况下实时可视化，并允许测试 Cx43 突变体的表达和其他处理对 IWCA 的影响图

图 7 | IKOCA 细胞中修饰的 Cx43 转基因的表达可以在没有内源 Cx43 表达的混杂影响的情况下实时可视化，并允许测试 Cx43 突变体的表达和其他处理对 IWCA 的影响。 (A) sfGFP-Cx43 和其他荧光蛋白标记的连接蛋白的表达允许 3D 时间推移 FRAP 实验来检查星形胶质细胞样细胞中的 GJ 斑块动力学 (IKOCA 第 18 段)。星形胶质细胞的薄形态有助于 3D、延时 FRAP，因为 GJ 斑块通常与成像焦平面几乎平行地形成。对于所示的示例图像，使用 11 个共焦平面对 GJ 的整个垂直宽度进行成像，每个堆栈以 3 秒的间隔采集。由此产生的 Z 堆叠被折叠成一系列最大投影重建，以可视化整个斑块结构随时间的荧光恢复。比例尺 = 2 µm。 (B) EBFP2-Cx43 与绿色荧光蛋白标签和传感器的表达允许对 Cx43 和其他细胞成分(如 msfGFP-ATG9A)之间的相互作用进行实时 4D 检查，显示为延时蒙太奇的最大投影(IKOCA 第 16 段，比例尺条 = 5 µm)。请注意，EBFP2-Cx43 GJ 斑块以洋红色显示，msfGFP-ATG9A 自噬蛋白以绿色显示。放大的插图显示了 IKOCA 星形胶质细胞中转基因表达的 Cx43 和 ATG9A 之间动态相互作用的细节。插入比例尺 = 1 µm。

5.通过与 IWCA 的共培养增强了内皮单层中的屏障形成

为了评估永生化星形胶质细胞系是否保留其与内皮细胞功能相互作用的能力，如在血脑屏障水平上观察到的，我们对与内皮 bEnd.3 细胞共培养的 IWCA 进行了研究。基于使用 CellZscope 设备监测数天的跨内皮电阻 (TEER) 的发展来评估屏障形成。如图 8 所示，有和没有 IWCA 的 bEnd.3 内皮细胞培养物的 TEER 随着培养时间的增加而增加。然而，从测量开始并持续到第 7 天，使用 IWCA 培养 bEnd.3 细胞的 TEER 显着高于单独使用 bEnd.3 或与 IKOCA 一起培养的 TEER(p 值 < 0.05)。从第 1 天开始， TEER (Ohm cm2) 的与 IWCA 的共培养显着高于单独的 bEnd.3 细胞 (7.31 ± 1.13 vs 1.67 ± 0.28, p = 0.00024) 和 IKOCA 与 bEnd.3 (7.31 ± 1.13 vs 4.33 ± 0.63, p = 0.033)。在第 7 天，与单独的 bEnd.3 细胞(23.17 ± 2.60 vs 9.34 ± 0.86，p = 0.00027)和 IKOCA 与 bEnd.3(23.17 ± 2.60 vs 12.56 ± 1.13，p = 0.0022)相比，差异仍然存在。这些 IWCA 共培养 TEER 值与其他人先前在使用连接到 EVOM 电阻计 (Srinivasan) 的 Endohm 室与原代大鼠星形胶质细胞共培养 5 天时报告的值相似等人，2015)。

Transwell 电阻 (TEER) 在单独的 bEnd.3 内皮细胞和与永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮质星形胶质细胞的共培养中测量图

图8. Transwell 电阻 (TEER) 在单独的 bEnd.3 内皮细胞和与永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮质星形胶质细胞的共培养中测量。使用 CellZscope 测量单独 bEnd.3 细胞的 transwell 培养物以及与 IWCA 和 IKOCA 共培养物的电阻增加。 N = 11-17 个单独的实验。通道数范围为 15-30。 ∗∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001 表示与单独的 bEnd.3 单元格相比的显着性。 ∧p < 0.05, ∧∧p < 0.01, ∧∧∧p < 0.001, ∧∧∧∧p < 0.0001 表示相对于 bEnd.3 + IKOCA 的显着性。混合效应分析用于测试每个时间点的显着性。

材料方法

细胞培养我们使用源自 19-20 日龄 (E19-20) 野生型 (WT) 和 Cx43-null 小鼠胚胎(C57Bl/6J-Gja1 菌株中 Cx43 杂合子的后代，最初从杰克逊实验室获得)的皮质星形胶质细胞的原代培养物.动物在阿尔伯特爱因斯坦医学院动物设施中饲养，所有实验程序均经学院动物护理和使用委员会批准，并使用先前描述的星形胶质细胞培养方法(McCarthy 和 de Vellis，1980)的修改进行。从全脑 E19-E20 胚胎中分离皮质，去除脑膜后，将组织切碎并酶消化(0.05% 胰蛋白酶，37°C 10 分钟)。通过离心收集来自每只动物的细胞并将颗粒悬浮在星形胶质细胞培养基 [ScienCell Research Laboratory (SCRL), cat# 1801] 中，辅以 2% 胎牛血清 (FBS) (SCRL cat# 0010)、1% 青霉素/链霉素 ( SCRL cat# 08030) 和 1% 星形胶质细胞生长因子 (SCRL cat# 1852)，接种在塑料培养皿中，然后在 37°C 下摇动过夜，以去除培养物中的非星形胶质细胞。从每只小鼠幼崽获得的星形胶质细胞培养物的基因型通过对尾部 DNA 的 PCR 来确定，如所述(Dermietzel 等，2000)。星形胶质细胞在培养中保持 10-14 天(100% 湿度;95% 空气/5% CO2，37°C)直到汇合，此时细胞像我们之前描述的成骨细胞那样永生化(Thi et al., 2010)。

永生化

我们使用人类端粒酶逆转录酶 (hTERT) 过表达系统来实现星形胶质细胞的永生化。 hTERT cDNA 从其原始构建体 hTERTpGRN145(ATCC，MBA-141;马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)进行 PCR 扩增，并亚克隆到 pLentiV5-EF1α 载体(从购买自 Invitrogen，cat#V49,610 的原始载体修改)。用含有 hTERTcDNA 9×105 转导单位(TU;颗粒/ml)的慢病毒颗粒转导 WT 和 Cx43-null 星形胶质细胞的汇合培养物。过夜温育后，将混合物更换为星形胶质细胞培养基。我们使用星形胶质细胞生长补充剂 (SCRL# 1,852)。选择该补充剂用于我们的小鼠细胞培养是因为它是专为星形胶质细胞培养(特别是人类星形胶质细胞)而设计的市售补充剂，我们打算开发平衡广泛实用性、方便性和与体内星形胶质细胞相似性的细胞培养方法。然后通过每两个月连续分裂来选择永生化细胞，从而根除不继续分裂的细胞。用 hTERT 病毒颗粒成功转导的细胞被指定为从第二代开始永生化，因为原代星形胶质细胞在第二代之后生长非常差。在不同的窝中独立进行四次永生化过程，以产生四个永生化 WT 皮质星形胶质细胞 (IWCA) 细胞系和四个永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞 (IKOCA) 细胞系。

定量聚合酶链反应

根据制造商的说明，在 Applied Biosystems 7,300 实时 PCR 系统(Forester City，CA，United States)中使用 SYBR GREEN Master Mix(Applied Biosystems)进行定量聚合酶链反应(qPCR)。简而言之，使用 SuperScript VILO cDNA Synthesis (Invitrogen) 将 2 µg 总 RNA 逆转录为 cDNA。扩增进行了 40 个循环，退火温度为 60°C，最终体积为 25 µl。最后，通过从 60°C 到 95°C 的温度梯度获得 PCR 产物的解离曲线。用于 qPCR 的引物列于表 1。扩增了四个永生化 WT 和 Cx43-null 星形胶质细胞系中的每一个的两个技术复制品。使用 Ct 方法计算分析的 mRNA 样品的相对基因表达水平，其中获得的感兴趣基因的值首先标准化为参考、管家基因、β-肌动蛋白的值，然后标准化为它们各自对照的值(非 hTERT 永生化细胞 - 第 1 代)。正如我们之前的研究(Thi et al., 2010)，比较 Ct 方法的验证是在对连续样品稀释度的目标和参考扩增 [Ct (Cttarget – Ctreference)] 的效率相等后获得的。保留早期传代的细胞并选择较晚的传代，如用于比较生物标志物表达的指示。

蛋白质印迹分析

溶解铺在 100 mm 培养皿中的汇合星形胶质细胞培养物，将等量的总蛋白加载到 7.5 或 10% SDS-PAGE 凝胶上进行分离，然后电泳转移到硝酸纤维素膜(Whatman，Dassel，Germany)上。用针对兔抗 Cx43 的多克隆抗体探测膜，1:10,000(Sigma，cat# C6219);小鼠抗 GFAP 1: 500 (Sigma cat# G3893)、山羊抗 GS 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-6640) 和山羊抗 AQP4 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-9888) ，然后与辣根过氧化物酶偶联的驴抗山羊 IgG、山羊抗兔 IgG 和山羊抗小鼠(1:10,000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, United States cat# SC-2020, SC -2004 和 SC-2005)。使用 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (EMD Millipore, MA, United States catalog# WBKLS0100) 检测蛋白质条带，并使用 In Vivo FX PRO 成像系统 (Carestream, Carestream, NY, United States) 获取图像。

染料偶联

我们使用了荧光黄 (LY) 的染料注射和加载 calcein-AM 的供体细胞的所谓“降落伞测定”来评估 GJ 介导的中等大分子(LY = 444 Da;calcein = 622 Da)的细胞间扩散。在相似汇合的星形胶质细胞培养物中进行染料注射。 LY 被离子电渗(0.1 µA 的连续电流)使用静电计(3100 型;A-M 系统)使用充满染料的锋利微电极(LY，150 mM LiCl 中的 5% wt;电阻 ~100 MOhms)进入单细胞。取出微量移液器后，立即使用一个 CoolSNAP-HQ2 CCD 相机(Photometrics，Tucson，AZ，美国)连接到带有 10X 干物镜(数值孔径 0.3)和 FITC 滤光片组的 Nikon 倒置显微镜。对 LY 注射细胞周围的荧光细胞进行计数，然后将这些值通过注入的感兴趣区域 (ROI) 内的细胞总数进行归一化，并表示为每个 ROI 的耦合细胞百分比。降落伞试验基本上按照所述进行(Stains 和 Civitelli，2016;McCutcheon 等人，2020a)。简而言之，培养中的细胞通过胰蛋白酶消化(Thermo Fisher Scientific，#25200056)分离，用 10 µM calcein-AM(Thermo Fisher Scientific，#C3100MP)悬浮加载，并用亲脂性 GJ 不渗透染料 DiI(Sigma Aldrich，# 468495-100MG) 30 分钟，以区分降落伞供体细胞和受体细胞。然后用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲液 (DPBS, Mediatech, Cellgro, VA, United States) 冲洗供体细胞并离心两次以去除残留染料，然后加入未标记受体细胞的汇合单层中。对于配对的 IWCA-IWCA、IKOCA-IKOCA 和异细胞 IWCA-IKOCA，确定了与用 GJ 渗透性钙黄绿素染料染色的供体细胞相邻的受体细胞数。该分析既是对 LY 注射的确认又是补充，因为它取决于 GJ 形成的速率和所形成的 GJ 的渗透性。

电耦合

双全细胞电压钳技术用于表征 IWCA 和 IKOCA 细胞的结电导，如所述 (del Corsso et al., 2006)。在 0 mV 的保持电位下对星形胶质细胞进行电压钳位，并将 8-10 秒的持续时间命令步骤 (V) 以 20 mV 的增量从 -110 到 +110 mV 或从 -100 到 +100 mV 呈现给一个细胞使用 pClamp 软件(Axon Instruments，Foster City，CA，United States)。在一些实验中，使用了电压斜坡协议，其中电压从 -100 缓慢增加到 +100 mV。在未步进的电池中记录结电流 (Ij)，结电导 (Gj) 计算为 -Ij/V (del Corsso et al., 2006)。贴片移液器装有(以 mM 为单位)140 CsCl、10 EGTA 和 5 Mg2ATP，pH 7.25。将细胞浸泡在含有(以 mM 计)140 NaCl、2 KCl、2 CaCl2、1 BaCl2、2 CsCl、1 MgCl2 和 5 HEPES，pH 7.2 的溶液中。 CoolSNAP-HQ2 CCD 相机(Photometrics，Tucson，AZ，United States)连接到带有 10X 干物镜(数值孔径 0.3)和 FITC 滤光片组的 Nikon 倒置显微镜。对 LY 注射细胞周围的荧光细胞进行计数，然后将这些值通过注入的感兴趣区域 (ROI) 内的细胞总数进行归一化，并表示为每个 ROI 的耦合细胞百分比。降落伞试验基本上按照所述进行(Stains 和 Civitelli，2016;McCutcheon 等人，2020a)。简而言之，培养中的细胞通过胰蛋白酶消化分离(Thermo Fisher Scientific，#25200056)，加入 10 µM calcein-AM(Thermo Fisher Scienticic，#C3100MP)悬浮液，并用亲脂性 GJ 不渗透染料 DiI(Sigma Aldrich，# 468495-100MG) 30 分钟，以区分降落伞供体细胞和受体细胞。然后用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲液 (DPBS, Mediatech, Cellgro, VA, United States) 冲洗供体细胞并离心两次以去除残留染料，然后加入未标记受体细胞的汇合单层中。对于配对的 IWCA-IWCA、IKOCA-IKOCA 和异细胞 IWCA-IKOCA，确定了与用 GJ 渗透性钙黄绿素染料染色的供体细胞相邻的受体细胞数。该分析既是对 LY 注射的确认又是补充，因为它取决于 GJ 形成的速率和所形成的 GJ 的渗透性。电耦合双全细胞电压钳技术用于表征 IWCA 和 IKOCA 细胞的结电导，如所述 (del Corsso et al., 2006)。在 0 mV 的保持电位下对星形胶质细胞进行电压钳位，并将 8-10 秒的持续时间命令步骤 (V) 以 20 mV 的增量从 -110 到 +110 mV 或从 -100 到 +100 mV 呈现给一个细胞使用 pClamp 软件(Axon Instruments，Foster City，CA，United States)。在一些实验中，使用了电压斜坡协议，其中电压从 -100 缓慢增加到 +100 mV。在未步进的电池中记录结电流 (Ij)，结电导 (Gj) 计算为 -Ij/V (del Corsso et al., 2006)。贴片移液器装有(以 mM 为单位)140 CsCl、10 EGTA 和 5 Mg2ATP，pH 7.25。将细胞浸泡在含有(以 mM 计)140 NaCl、2 KCl、2 CaCl2、1 BaCl2、2 CsCl、1 MgCl2 和 5 HEPES，pH 7.2 的溶液中。

荧光蛋白标记的 Cx43 的瞬时外源表达

永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞用 superfolderGFP 标记的 Cx43、msfGFP-rCx43、EBFP2rCx43、sfGFP-Cx30、sfGFP-Cx26 转染(Stout 等人，2015;Stout 和 Spray，2016 ) 和 msfGFP-ATG9A。这恢复了 Cx43 表达，以允许将外源表达的 Cx43 聚集体与原代 WT 星形胶质细胞培养物中的内源表达斑块进行比较。在补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scienticic，#15070063)的 DMEM(Thermo Fisher Scientic，#11885084)中将细胞接种到 50-60% 的融合度。转染前两小时，更换培养基。对于转染，1 µg DNA 与 100 µL Opti-MEM(Thermo Fisher，#31985062)和 5 µL 转染试剂(Mirus TransIT LT1，#MIR2300)和室温孵育 20-30 分钟。然后将脂质体-DNA 复合物逐滴添加到 IKOCA 单层中，并在标准培养条件下孵育 2-4 天，无需更换培养基，然后成像。

共聚焦显微镜分析星形胶质细胞蛋白的分布并比较内源性

Cx43 连接与荧光蛋白标记的 Cx43 形成的连接为了评估 WT 和 Cx43null 原代星形胶质细胞和永生化细胞系中的蛋白质定位，将培养物铺在盖玻片上，用 4% 多聚甲醛固定( PFA)，用 0.4% Triton-X100 透化，并用 2% 驴血清封闭 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, United States)，如前所述 (Scemes et al., 2000)。然后将细胞与针对兔抗 Cx43 的一抗以 1:1,000(Sigma，cat# C6219)孵育;小鼠抗 GFAP 1: 500 (Sigma cat# G3893)、山羊抗 GS 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-6640) 和山羊抗 AQP4 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-9888) ，以及与 Alexa-488 goatanti-mouse IgG (cat#A11001)、Alexa Fluor 594 Donkey Anti-goat (cat#A-11058) 和 Alexa-488 goat anti-rabbit IgG (cat#A-11034) 偶联的二抗( 1:1000，英杰公司)。将盖玻片安装在载玻片上，在具有 40 倍水浸物镜的 Zeiss LSM 510 DUO 激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)上进行检查。堆叠图像以 0.6 µm z 轴步长连续拍摄。

如上所述，Cx43 在透化细胞中用原代兔多克隆抗体(1:1000;Abcam，#ab11370)进行免疫标记，或者通过转染细胞中 GFP 标记的 Cx43(绿色荧光蛋白)的荧光信号进行识别。使用蔡司 LSM 880 倒置显微镜和 63 倍油镜(数值孔径，1.4)获得图像采集和免疫标记的连接斑块的 z 堆栈。使用蔡司 5Live Duo 和 63 倍油浸物镜在 37°C 下获得活细胞中外源表达 GFP 标记的 Cx43 的 GJ 斑块的 Z 堆叠。活细胞的成像介质是不含酚的 DMEM(Thermo Fisher Scientic，#31053028)，辅以 10% FBS、1% PS 和 25 mM HEPES(Thermo Fisher Scientic，#15630080)。

通过免疫荧光共染色转染表达荧光蛋白标记连接蛋白的 IKOCA 细胞成像

永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞在 Ibidi 8 孔 ibiditreat 载玻片 (Ibidi Inc.) 中生长，然后用 EBFP2-Cx43 转染，然后转染 48转染后 h，将其在 4% PFA 中固定 10 分钟，用 0.4% Triton-X100 透化，用 2% 驴血清封闭，然后使用兔抗 Cx43 抗体进行免疫染色(图 6A，Sigma，cat#C6219，1:500 ) 或与 Alexa Fluor 488 偶联的针对绿色荧光蛋白的羊驼抗体(也标记 EBFP2，图 6B，Chromotek，cat# gb2AF488，1:100 稀释)，以增强绿色通道中的 EBFP2 信号连同 DAPI(蓝色染色细胞核)。为了共同标记线粒体，我们用 TOMM20 一抗(Invitrogen，cat# MA5-32148, 1:500)染色，然后用驴抗兔 Alexa Fluor 647 进行二次染色(图 6B，Invitrogen，cat# A-31573, 1： 500)。我们用 Alexa 488 山羊抗兔 IgG(Invitrogen，cat# A-11034, 1:500)对图 6A 中的细胞进行染色。一抗标记在室温下搅拌 1 小时，然后在 4 度下过夜。二抗染色在室温下搅拌 3 小时。图 6 中的图像是使用配备 63 × 1.4NA Plan-Apochromat 油浸物镜的 Zeiss 980 Airyscan2 激光扫描显微镜拍摄的。图 6B 中的缩小图像具有绿色通道的非线性强度查找表，以允许读者同时看到非常密集标记的反射 GJ 斑块和非结膜定位的 Cx43。所有其他图像查找表都按信号强度线性缩放。

通过瞬时转染对表达荧光蛋白标记蛋白的 IKOCA 细胞进行光漂白实验后的实时成像和荧光恢复永生化 Cx43-null 皮质星形胶质细胞在 Ibidi 8 孔腔载玻片中生长，如前几节所述转染。 sfGFP-Cx43、sfGFP-Cx30 和 sfGFP-Cx26 如前所述用于其他细胞类型(Stout 等人，2015)。将细胞转移到不含酚红的 DMEM 中含有 10% FBS、25 mm HEPES 和 2 mm 谷氨酰胺的成像介质中。图 7 中的现场实验是在配备 63 × 1.4 NA 物镜的 Zeiss 5live Duoscan 510 共焦激光扫描显微镜上进行的。 3D FRAP 实验是通过将 11 平面 Z 堆栈采集集中在 GJ 斑块上然后每 3 秒采集 11 平面 3D 图像来进行的。使用 488 nm 激光以 100% 进行条纹光漂白，重复三次。将生成的 3D 延时图像转换为最大投影正交重建，以生成图 7A 中的单平面延时图像系列。对于图 7B，IKOCA 细胞与 EBFP2Cx43 (McCutcheon 等人，2020b) 以及在氨基末端标记的人类 ATG9A 与标准亚克隆技术产生的单体超折叠 GFP (msfGFP) 共转染，可根据要求提供质粒序列。然后用 11 个平面 Z 堆栈采集对细胞进行成像，每个焦平面依次成像蓝色和绿色通道。生成的双色 3D 延时被折叠为最大投影正交投影的延时序列，以显示在图 7 中。

测量 IWCA-内皮共培养物的屏障形成) DPBS 中的溶液。在 95% 空气/5% CO2 的加湿培养箱中，在 37°C 下培养涂层刀片 1 小时。 IWCA 是然后以 30,000 个细胞/cm2 的密度接种，让细胞粘附在 FN 涂层的 Transwell 插入物上 2 小时，然后再次翻转插入物并放入 12 个多孔板中，IWCA 细胞现在面向板的底部, 并在 DMEM 中培养 2 天。然后将小鼠脑内皮细胞(bEnd.3 细胞，ATCC CRL-2299，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)以 60,000 个细胞/cm2 的密度接种在插入物的腔侧，并在 DMEM 中生长。没有 IWCA 的伴侣插入物单独接种 bEnd.3，以比较它们的屏障功能与共培养物的屏障功能。使用 cellZscope 系统(Nanoanalytics，Munster，Germany)测量内皮单层的跨内皮电阻 (TEER) 和内皮单层与 IWCA 的共培养物，用于自动、长期监测屏障电阻。将每个接种有细胞的插入物放入充满培养基 (DMEM – 10% FBS) 的腔室中，并将腔室支架移至培养箱 (37°C, 5% CO2) 并连接到控制器。 CellZscope 软件每 6 小时测量一次 TEER。每 3 到 4 天更换一次室中的培养基和插入物，在插入物上接种 bEnd.3 细胞后监测 TEER 长达 7 天。

统计分析 GraphPad Prism 8 和 9.0.1 软件用于数据和统计分析。

数据表示为平均值 ± SEM，在 *P < 0.05 时被认为具有统计学意义。通过染料注射分析的未配对学生 t 检验确定统计差异。单因素方差分析和 Dunnett 的多重比较测试用于蛋白质印迹分析和降落伞染料转移测定。混合效应分析用于在每个时间点比较组间的 TEER。

结论与讨论

与 IWCA 的共培养显着高于单独的 bEnd.3 细胞 (7.31 ± 1.13 vs 1.67 ± 0.28, p = 0.00024) 和 IKOCA 与 bEnd.3 (7.31 ± 1.13 vs 4.33 ± 0.63, p = 0.033)。在第 7 天，与单独的 bEnd.3 细胞(23.17 ± 2.60 vs 9.34 ± 0.86，p = 0.00027)和 IKOCA 与 bEnd.3(23.17 ± 2.60 vs 12.56 ± 1.13，p = 0.0022)相比，差异仍然存在。这些 IWCA 共培养 TEER 值与其他人先前在使用连接到 EVOM 电阻计 (Srinivasan) 的 Endohm 室与原代大鼠星形胶质细胞共培养 5 天时报告的值相似等人，2015)。

间隙连接介导的细胞间通讯在 IWCA 线中得到维持，在 IKOCA 线中非常低。关于小分子量染料的转移，细胞内注射的 LY 和加载酯的钙黄绿素对细胞之间的连接具有高度渗透性。电耦合的电生理测量发现 IWCAcell 对之间的结电导平均为 17nS，这与我们之前在这些细胞的原代培养物中报道的 13nS 的值相似(Dermietzel 等人，2000)。结电导的电压敏感性独特的生物物理特性由每个连接蛋白形成的 GJ 与 Cx43 所报道的相似(Dermietzel etal2000)

允许哺乳动物细胞在培养物中长时间维持的方法的开发是开创细胞生物学领域的一项重大成就和细胞神经科学。与致癌转化的细胞系相比，来自某些组织的细胞类型在培养中仍然更难提取和维持。从组织中提取的大多数分化的原代细胞在衰老之前经历了有限数量的细胞分裂，因此需要连续收集细胞以维持从组织中分离出来的材料的供应以进行研究。最常用的转化细胞系对细胞生物学研究做出了巨大贡献，但也存在许多众所周知的缺点，包括细胞表型、信号通路和细胞间相互作用特征的重大变化。因此，需要获得连续分裂并且还表达与感兴趣的细胞类型相似的表型的细胞系。

获得永生化细胞系的常规方法涉及从肿瘤中分离细胞 [参见 (Souza et al., 2016)，最初产生的细胞系示例(早于 1960 年)是小鼠肺细胞系 (L1)，得到高度讨论和广泛使用的人宫颈细胞系 [HeLa; (Lucey et al., 2009)] 和中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)]，但此后已有数千种其他细胞系来源于肿瘤并在某种程度上进行了表征。现在已知这些细胞系来自表达癌基因的细胞。 HeLa 细胞被人乳头瘤病毒 (HPV) 感染，该病毒会合成使肿瘤抑制分子 p53 和其他分子失活的蛋白质 (Lechner et al., 1992)。

对肿瘤发生机制的研究利用了 SV40，这是一种在用于生产脊髓灰质炎病毒疫苗的猴子细胞系中发现的多瘤病毒。 SV40 感染猴子细胞，激活早期和晚期基因的表达，并且不会在猴子体内产生肿瘤。在啮齿动物细胞中，SV40 产生大小 T 抗原以抑制 pRb 和 p53 以及蛋白磷酸酶 (PP2A) (Ahuja et al., 2005)。在小鼠中，SV40 病毒感染导致肿瘤的诱导，并已被用于生成许多广泛使用的小鼠细胞系 [在 Hudson 和 Colvin (2016) 中进行了综述]。在细胞培养中，SV40 感染导致细胞转化，通常被测定为失去接触抑制生长、在软琼脂中生长的能力和生存所需血清的减少。目前使用的大多数细胞系都是通过这种方法产生的，因此表现出转化的表型。例如，American Tissue Cell Collection 存储库包含七个星形胶质细胞系。其中一种 DI TNC-1，通过 GFAP 靶向癌基因递送至新生大鼠间脑星形胶质细胞(Radany 等，1992)获得，具有低水平的内源性水通道蛋白，因此已成为研究在星形胶质细胞中表达的外源性构建体的有用模型-相似的转化细胞系[例如，(Mola et al., 2016)]。甚至可以在市场上购买专门针对此类研究定制的产品1。

用于原代细胞永生化的较新的替代方法是掺入 hTERT，它保留了端粒的长度，从而赋予细胞自我更新的特性。 hTERT 引入与使用病毒蛋白进行永生化相比具有优势，因为它不涉及肿瘤抑制基因的失活，从而绕过转化的表型(Kogan 等，2006)。因此，hTERT 永生化产生的细胞通常比病毒转化细胞更类似于原代细胞，尽管这两种永生化方法都逃脱了衰老前有限数量的细胞周期，并且可能无法完全模仿它们来源的细胞的特性.

大多数使用细胞系评估 GJ 表达对星形胶质细胞表型影响的研究都使用了 C6 神经胶质瘤细胞 (ATCC #CCL-107)。该细胞系来源于亚硝基甲基脲暴露产生的大鼠脑肿瘤，最初的特征是富含 S100 蛋白和纺锤形(Benda 等，1968)。 C6 细胞系广泛用于胶质母细胞瘤侵袭的研究，因为它在体内形成健壮的肿瘤。它被描述为包含两种细胞群，一种具有未成熟少突胶质细胞的标志物，另一种是少突胶质细胞和未成熟星形胶质细胞的混合物(Coyle，1995)。值得注意的是，GFAP 表达不存在并且波形蛋白表达在 C6 神经胶质瘤细胞中是可变的 (Chou et al., 2003)。关于 GJ 研究，发现 C6 神经胶质瘤细胞比星形胶质细胞表达更少的 Cx43，并且被认为严重缺乏交流(Naus 等，1991)。在许多研究中，据报道，这些细胞中 Cx43 的过表达会降低体内肿瘤生长速率和培养中的细胞增殖 [参见 (Zhu et al., 1992)]。然而，C6 细胞与星形胶质细胞形成功能性 GJ (Zhang et al., 1999)，最近大量研究表明，通过 Cx43 通道的 GJ 通讯在胶质母细胞瘤侵袭中起主要作用 [参见 (Umans and Sontheimer, 2018)]。对原代小鼠星形胶质细胞培养物观察到相反的效果(从 Cx43 缺失小鼠中提取的星形胶质细胞增殖减少)(Naus 等人，1997;Dermietzel 等人，2000)。我们在此报告的成对 Cx43-null 和 WT 星形胶质细胞的多个系(其他星形胶质细胞蛋白的表达有所不同)将有助于阐明这些与 Cx43 表达对星形胶质细胞增殖相关的有趣发现，因为 Cx43 的突变形式可以在IKOCA 细胞(如图 5-7 所示)剖析 Cx43 对细胞生长影响的机制基础，特别是在没有当前基因组编辑技术固有的潜在脱靶效应的完全 Cx43 无效背景下。

很少有与肿瘤发生问题直接相关的研究对源自 Cx43 缺陷星形胶质细胞的星形胶质细胞进行。然而，很明显，在 C6 细胞中操纵 Cx43 表达可能会产生与星形胶质细胞截然不同的后果。例如，在一项比较 WT C6 细胞与三个 Cx43 转染克隆的基因表达水平的研究中，发现只有七个不同的基因被上调或下调(Naus 等，2000)。在转录组范围的研究中，比较来自 WT 小鼠的星形胶质细胞与来自 Cx43-null 小鼠的星形胶质细胞(Iacobas 等人，2003)或用 siRNA 敲低 Cx43 后(Iacobas 等人，2008)，数百个基因被上调或下调。 Cx43-null 和 Cx43 敲低星形胶质细胞中的基因调控在某种程度上相似(Iacobas 等，2008)，但在 Cx43null 或 Cx43 敲低星形胶质细胞中，在转染的 C6 细胞中鉴定的基因都没有受到调控。使用 hTERT 使我们描述的星形胶质细胞系永生化预计比致癌基因诱导的细胞转化具有更少的副作用信号网络，但应该注意的是 Park 等人。 (2009) 报道 hTERT 表达可以调节 Wnt 通路。未来研究的一个有希望的领域可以通过 LoxP 或 CRISPR-Cas9 介导的切除 IWCA 和 IKOCA 细胞中使用的转基因来检查 hTERT 转基因和外源表达对 Wnt 和下游途径的影响。重要的是，本研究中表征的多个细胞系和重新表达 Cx43 的能力将允许通过多个细胞系进行更可靠的研究，并控制 Cx43 在其他细胞途径上的表达 [Cx43 和 Wnt 途径之间存在强烈的相互相互作用(范德Heyden et al., 1998; Ai et al., 2000; Hou et al., 2019; Lopez et al., 2019)]。

这里开发的细胞系表现出原代星形胶质细胞的特征，并且有望为评估星形胶质细胞 GJ 的作用提供新的机会，而不是来自胶质母细胞瘤或其他肿瘤的细胞。例如，未来研究结合伙伴及其对星形胶质细胞蛋白的亲和力(McCutcheon 等人，2020b)可能更类似于在更自然的环境下在体内发生的研究(尽管 IKOCA 中存在 Cx26 表达)应考虑文化)。还必须考虑的是，我们发现永生化星形胶质细胞系、Cx43 基因型之间以及传代数之间在一些已知在体内星形胶质细胞中表达的蛋白质的表达方面存在很大差异。鉴于在原代细胞培养中观察到的星形胶质细胞与体内表达水平相比存在显着的基因和蛋白质表达水平差异，这一发现并不令人惊讶。此外，星形胶质细胞基因表达在发育过程中、皮质亚区域之间，甚至大脑皮层同一区域的不同层之间存在已知的异质性(Batiuk 等人，2020 年)，并由多个小组审查(Schitine 等人，2015 年) ;Farmer 和 Murai，2017 年;Westergard 和 Rothstein，2020 年)。体内星形胶质细胞基因表达之间的显着差异使得从整个皮质星形胶质细胞群培养的永生化星形胶质细胞中基因表达水平的显着差异的发现不足为奇，因为细胞经历永生化，这代表了培养细胞群的瓶颈。跨代数的永生化星形胶质细胞系之间的差异可能是由于培养细胞的生长因子信号传导和改变的细胞外环境与已发现其他脑细胞类型会深刻改变星形胶质细胞基因-蛋白质表达的体内条件的差异造成的(Hasel 等人., 2017)。 GLT-1 在培养的星形胶质细胞中的表达被证明取决于神经元和内皮细胞(Martinez-Lozada 和 Robinson，2020)。因此，对于分离的永生化星形胶质细胞培养物，预计 GLT1 表达较低或检测不到。永生化星形胶质细胞与神经元和脑内皮细胞的共培养是否可以在 hTERT 永生化星形胶质细胞中诱导 GLT-1 表达是未来研究的一个令人兴奋的领域。此外，可以检查 Cx43 存在或缺乏的影响，我们根据实验结果预测 GLT-1 定位的差异，当 Cx43 和谷氨酸转运蛋白在非星形胶质细胞系中过度表达时(McCutcheon 等人，2020b) .预计蛋白质表达随传代次数的变化也会发生在在广泛使用的转化细胞系(如 HeLa 细胞和其他高传代细胞系)中产生显着基因型和表型差异的众多机制。我们在图 6、图 8 中显示了数据，其中细胞使用的通道比我们在本研究中描述的通道更远。未来研究有和没有 Cx43 表达的星形胶质细胞对自噬和细胞旁紧密连接促进的影响将需要验证 Cx43 表达或缺乏表达和其他星形胶质细胞标志物，但这些图中呈现的结果确实表明这些细胞可以使用到更高的通道数而不会遇到衰老。 hTERT 衍生的缺乏衰老意味着我们在本报告中开发和描述的永生化星形胶质细胞可能不适用于衰老和发育过程中的星形胶质细胞生理学研究。除了内皮细胞表达对星形胶质细胞表达的影响外，图 1、2 中的发现表明 AQP4 的表达随着传代次数减少，这意味着 AQP4 表达水平的验证对于未来使用此处描述的永生化星形胶质细胞系很重要。未来检查 Cx43 表达和功能结果的影响的研究将需要测试 AQP4 的水平和细胞定位，因为过去的研究显示了 Cx43 和 AQP4 之间的直接相互作用(Rash 和 Yasumura，1999;Nicchia 等，2005 ; Katoozi 等人，2017 年，2020 年)。先前的研究表明，IL-1β、IL-1α、NFκB 和其他因子在体内和原代星形胶质细胞培养物中对基因表达、形态和 GJ 连接产生重要变化。永生化星形胶质细胞的反应以及炎症和细胞损伤条件下 Cx43 表达的影响是 IWCA 和 IKOCA 星形胶质细胞在未来研究中的另一个令人兴奋的应用。

上述调查领域中的一些可以从使用此处描述的 WT 和 Cx43null 永生化细胞系中受益。星形胶质细胞的特性及其对生理和病理条件的反应取决于 Cx43 表达的程度，以及使用源自同胞 WT 和 Cx43-null 小鼠的这些星形胶质细胞系应该容易获得和促进负责任的分子机制和结构域的识别。