产品描述
小鼠肝胆管(扩增)类器官培养试剂盒（Mouse Liver Ductal Organoid Kit，Expansion）是一 种化学定义的细胞培养基，用于建立和培养从成体干细胞衍生的小鼠肝胆管类器官。肝胆管的 自我更新上皮细胞是由位于肝脏的干细胞及其祖细胞的扩增所驱动的。肝胆管类器官因其上皮 在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面的表现，而具有真实器官的特征。肝胆管类器官 可以在分化培养基中诱导出肝样细胞，为小鼠类肝脏发育和疾病的研究提供了前所未有的模型。
产品信息
表 1. 试剂盒组成信息
| 产品货号 | 产品名称 | 产品规格 |
| IMV-NM04LBM | 小鼠肝胆管(扩增)类器官基础培养基 | 500mL |
| IMV-NM04SBM | 100mL | |
| IMV-NM04L1 | 小鼠肝胆管(扩增)类器官培养因子 B | 10mL |
| IMV-NM04S1 | 1mL | |
| IMV-NM04L2 | 小鼠胃类器官培养因子C小鼠肝胆管(扩增)类器官培养因子 C | 1mL |
| IMV-NM04S2 | 0.4mL |
小鼠肝胆管类器官完全培养基的制备
1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；
2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进 行分装，推荐分装成 10mL 规格；
3. 将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。
注意：
分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；
解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内用；
类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。
小鼠肝胆管类器官的建立与传代培养
原代小鼠肝胆管类器官的建立
1. 用 50 或 15mL 离心管在预冷的原代组织保存液中收集原代小鼠肝组织片。将组织样品 保持在 4°C，直到开始分离。
2. 评估获得的组织片是否纯粹由上皮组成，或者是否也含有脂肪或肌肉组织。如果是， 在解剖显微镜下，尽可能使用手术剪刀或手术刀和镊子去除非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉 组织存在，立即继续下一步。
3. 用上皮类器官基础培养基或 DPBS 冲洗肝组织，直到上清清澈。
4. 将基质胶在冰面上解冻并保持低温。
5. 在细胞培养皿中，用外科剪刀或手术刀将组织切成 5 mm3 的小碎片。解剖的样品必须 足够小，能够通过 10ml 移液管的尖端。
6. 将肝组织样本放入 15mL 离心管中，管内含有 10mL 预冷的上皮类器官基础培养基 (含 1% FBS)。
7. 用 10mL 移液器上下吹打至少 10 次，清洗样品。在接下来的步骤中，使用前在移液管 头的内表面涂上抗粘附冲洗液，以避免样品粘附在移液管壁上。
8. 让试管静止，直到样品沉淀在底部。用 10mL 移液管抽吸上清，加入 10mL 预热组织消 化液。
9. 在 37℃下以 100 转/分的转速消化肝组织。消化时间不应超过 30 分钟。为防止消化过 度，应在显微镜下检查消化过程中是否出现胆管结构。
10. 一旦胆管结构出现，通过添加 2%FBS 停止消化，然后轻轻地上下吹打。
11. 静置 1-2 分钟，将上清液移入新管。
12. 加入 10mL 上皮类器官基础培养基，再次重复步骤 11。
13. 在 4°C 下，300g 旋转上清 3 分钟。抽吸并丢弃上清。
14. 用 10mL 上皮类器官基础培养基重新悬浮组织，在 4°C 下，300g 离心 3 分钟。
15. 重复步骤 14 两次。
16. 抽吸上清液，在基质胶中重悬微球。基质胶应冰冻保存，防止其凝固;因此，工作要迅 速。基质胶的量取决于颗粒的大小。大约每 25 μL 的基质胶含有 20-100 个胆管结构。切勿过多稀释基质胶 (基质胶浓度应大于 70%)，以确保形成固体胶滴。
17. 在 24 孔细胞培养板的底部，将含类器官的基质胶滴在孔中心周围约 30 μL 的液滴 中。一旦类器官在基质胶中重悬，尽快进行接种，因为基质胶可能会在管或移液器尖端凝固。 不要让基质胶接触孔壁。
18. 将培养板放入 37°C 和 5%CO2的培养箱中 15-25 分钟，使基质胶凝固。
19. 准备所需量的小鼠肝胆管类器官培养基。基质胶液滴凝固后(15- 25min)，打开平板， 每孔小心地加入 500 μL 完全培养基。不要直接将培养基添加到基质胶液滴的顶部，因为这可能会破坏液滴。
20. 将培养板置于 37°C 和 5% CO2的培养箱中。
21. 每 3 天更换一次培养基，小心地从孔中抽吸培养基，并用新鲜的、预热的小鼠肝胆管类器官培养基代替。密切监测类器官的形成。理想情况下，小鼠肝胆管类器官第一次传代应在 5 至 8 天之间。
小鼠肝胆管类器官的传代培养
1. 用移液枪吹打破坏基质胶，并将类器官悬液转移到 1.5 mL 锥形管中。
2. 用移液枪吹打使类器官悬浮液充分混合。
3. 在室温下 300g 离心 3 分钟。
4. 抽吸上清，使用机械破坏或类器官消化液分离类器官。
(Ⅰ) 对于机械破坏，将类器官重悬在 1mL 类器官基础培养基中。用移液管尖端将类器官 悬浮液上下移动 30 次。用管子底部制造压力，这将有助于类器官的破坏。
（Ⅱ）类器官消化液消化，将基质胶和类器官混合物重悬于类器官解离液中（10 倍体积）， 吹打混匀，37℃孵育至类器官分离。每 1 分钟用移液枪吹打 10 次，以帮助解离类器官。密切监测消化，以保持在类器官解离溶液中的孵育时间最短。
注意：不要在类器官解离液中解离超过3分钟，因为这可能导致类器官生长不良甚至丢失培养物。根据经验，如果可以观察到小块细胞的混合物(由5-10个细胞组成)，则消化完成。
5. 解离完成后，加1mL基础培养基洗一次，室温下300g离心3分钟。
6. 抽吸上清，用 70% 的基质胶重悬类器官，类器官胶滴接种在培养板底部。将孔板板转 移到 37°C 和 5% CO2的培养箱中 15-25 分钟。 7. 37℃预热小鼠肝胆管类器官扩增培养基。
8. 在基质胶凝固后(15-25 分钟)，小心地将预热过的培养基加入孔板中。
9. 将培养板置于 37°C 和 5% CO2的培养箱中静置培养，每天于显微镜下观察类器官的生长状态，每 3 天于显微镜下拍照并记录多个视野中的类器官的形态。
