产品描述
小鼠结肠类器官培养基套装（Mouse Colonic Organoid Kit）是一款用于扩增和分化小鼠结 肠类器官的完全培养基。扩增时的小鼠结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成，分化 后的小鼠结肠类器官由结肠吸收细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成。结肠类器官在自我 更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是小鼠 结肠研究的理想体外模型。
产品信息
表 1. 试剂盒组成信息
| 产品货号 | 产品名称 | 产品规格 |
IMV-NM19LBM | 小鼠结肠类器官基础培养基 | 500mL |
IMV-NM19SBM | 100mL | |
IMV-NM19L1 | 小鼠结肠类器官培养因子B | 10mL |
IMV-NM19S1 | 1mL | |
IMV-NM19L2 | 小鼠结肠类器官培养因子C | 1mL |
IMV-NM19S2 | 0.4mL |
小鼠结肠类器官完全培养基使用说明
1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻；
2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进 行分装，推荐分装成 10mL 规格；
3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。
注意：
分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融；
解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用；
类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。
小鼠结肠类器官的建立与传代培养
原代小鼠结肠类器官的建立
1.取样：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近盲肠端 3~5cm 结肠组织， 用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入 4℃预冷的含双抗的 DPBS 溶液中。
2.清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一 只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便，接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗。 将清洗后的肠组织剪碎至 2-5mm 宽，随后转移至 50ml 离心管中，剧烈震 荡 30s(垂直上下震荡 90 次一上一下算一次，约 1s 三次) 弃上清，重复 3 次。
3.消化：加入 30 mL 的 DPBS 溶液中再加入 150 μL 0.5M EDTA，至 EDTA 终浓度为 2.5mM。置 4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。
4.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷 DPBS，轻柔摇匀，静置后弃 上清，重复 2 次以去除 EDTA。
5.重悬：加入 30 mL 预冷的含 1%FBS 的 DPBS，涡旋 30s，取上清 70μm 滤网过滤，收 集穿过滤网的组织悬液，记为馏分 1。重复收集 2 次，记为馏分 2 和馏分 3。
6.收集：300g 离心力 4℃离心 3min。
7.计数：弃上清，根据沉淀量使用 DPBS 重悬组织沉淀，取 20μL 悬液进行镜检和隐窝 计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰 上。
8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10μL 基质胶悬液包含 100 至 200 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
9.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30 μL 左右，避免悬液 接触孔板侧壁。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min 左右待基质胶凝 固。
11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠结肠类器官完全培养基，24 孔板 每孔 500μL，避免破坏已凝固结构。
12.将24 孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。
13.每2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状 态，理想情况下，小鼠结肠类器官应在5 至7 天内建成。
小鼠结肠类器官的传代培养
1.用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过 润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。
2.用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。
3.300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消 化液并充分混匀，37℃条件下消化 1- 3 min，消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹 打混匀。
4.300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。
5.300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。
6.用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基 质胶过早凝固。
注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
7.将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每 孔 30 μL 左右。
注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
8.将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶 凝固后取出。
9.待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的小鼠结肠类器官完全培养基，24 孔板每 孔 500 μL。
10.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。
