产品描述
本产品为hPSC诱导分化内耳类器官试剂盒,人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到内耳类器官,该类器官具类似内耳的细胞组成,生长过程中有分化出耳泡结构及毛细胞。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验,对类器官具有一定了解。
实验仪器、材料
仪器:生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料:6孔细胞培养板、超低吸附96孔板、离心管(规格为15 mL 和 50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL和多通道100μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)
试剂盒内容
试剂盒使用流程
①EB形成(2天)
1. hPSC于VTN包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
2. 吸去培养基。
3. 孔中加入1mL PBS(无钙镁离子)洗,吸去。
4. 孔中加入1mL Tryple express,37℃消化5min。
5. 于两只15mL 离心管中分别加入10mL EB形成培养基,并补充10μM Y27632。(注意:所用培养基均应提前在工作台放置30min以恢复室温,后面操作同理。)
6. 消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。
7. 吸去Tryple express,每孔加入1mL EB形成培养基终止消化。
8. 轻轻吹打孔内细胞2-3次,将细胞悬液移至有9mL EB形成培养基的15mL离心管中。
9. 100g离心5min,吸弃上清。
10. 向细胞沉淀加入10mL 步骤5获得含10μM Y27632的EB形成培养基,重新制成细胞悬液。
11. 将细胞悬液移至加样槽,使用多通道移液器种到超低吸附96板中,每孔100μL,接种96个孔,普通96孔板每孔加100μL PBS,96孔作为配平。
12. 于低速水平离心机,850rpm/120g离心3min,将板放入37℃,5%CO2的培养箱,记为D-2。
13. 第2天(D-1)可以看到形成大小均一的EB。每孔补充100μL不含Y27632的EB形成培养基,放入37℃,5%CO2的培养箱。
(注意:补充EB形成培养基后,可将多通道移液器枪头置于液面下轻轻吹打,在不影响到EB的情况下混匀培养基。)
②EB分化阶段(12天)
14. D0,解冻补充剂A,吸弃培养基,9.6mL预冷的基础培养基1与补充剂A、200μL Matrigel混合均匀,恢复至室温后,按每孔100μL,加到96孔板中,诱导EB分化,用多通道移液器轻轻吹打,使EB悬浮。在37℃,5%CO2培养箱中培养4天。
15. D4,解冻补充剂B,2.5mL基础培养基1+补充剂B混合均匀,按每孔25μL,加到96孔板中,并轻轻移液8-10次混匀,使每孔培养基的终体积为125μL,将96孔板放回培养箱,37℃,5%CO2培养4天。
16. D8,解冻补充剂C,2.5mL基础培养基1+补充剂C混合均匀,按每孔25μL,加到96孔板中,并轻轻移液8-10次混匀,使每孔培养基的终体积为150μL,将96孔板放回培养箱,37℃,5%CO2培养4天。
③耳泡形成阶段(6天)
17. D12,EB诱导结束,准备好基础培养基2(提前在冰上冷藏至少30min);或者,在d11上使基础培养基2存储在4°C过夜。Matrigel提前与补充剂D于4℃解冻,冷的基础培养基2与补充剂D混合均匀。将200uL Matrigel加入20mL冷的混合培养基中,反复吹打溶解20次,复温到室温。将96孔板中的聚集物转移到两个100mm培养皿中,每个培养皿中有48个聚集体。用1-2mL的DPBS洗涤聚集体2次,再用1mL不含Matrigel的混合培养基洗涤1次,然后分别加入10mL含Matrigel的混合培养基,将培养皿放入培养箱中,37℃,5%CO2 培养3天;D15吸掉培养皿中的培养基,重新加入不含Matrigel的混合培养基,继续培养3天,诱导耳泡形成;
(注意:10mm皿一般换液需要10ml培养基)
④内耳类器官成熟阶段(42天)
18.D18-60,内耳类器官逐渐成熟,将培养基换成成熟培养基,开始长期培养,每5天换一次液,到60天左右获得具有感觉毛细胞的成熟内耳类器官。