产品介绍
本产品iHHOs为hiPSC诱导分化肝类器官，该类器官由肝细胞组成囊泡状结构，成熟后的类器官具有肝干细胞和肝祖细胞的双表型特征。在体外培养条件下可维持60天，并稳定传代扩增、冻存和复苏。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对类器官具有一定了解。
注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。
hiPSC诱导分化肝类器官iHHOs
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱、恒温水浴锅。
材料：24孔细胞培养板、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10 mL、50 mL）。
鉴定结果
操作步骤
一、iHHOs复苏
1. 基质胶在4℃下解冻，恒温水浴锅37℃预热，100 μL枪头于-20℃预冷，194.8 mL iHHOs基础培养基与5.2 mLiHHOs培养补充剂混匀制备iHHOs完全培养基。（ 注意：配制iHHOs完全培养基需在2周内用完，可将iHHOs培养补充剂分装冻存，根据实验需要配制iHHOs完全培养基，避免反复冻融 ）。
2. 将冻存管从液氮罐中取出，在37℃水浴锅中快速解冻，当剩少许浮冰时，取出，酒精消毒，转移到生物安全柜中。
3. 将解冻好的细胞悬液转移到15离心管中，缓慢加入9mL复温的DMEM/F12（含10 μM Y27632），150g离心5min。
4. 去上清，加入30 μL基质胶，均匀混合基质胶-单细胞，用预冷枪头将30 μL基质胶加到孔中心，然后转移到培养箱中，20-30min，使胶滴凝固。
5. 取出培养板，小心沿孔壁加入恢复室温的700μL iHHOs完全培养基，注意不要碰到胶滴。注意：所用试剂除标注“预冷”外，在使用前均需恢复至室温。
6. 将孔板放到培养箱中，继续培养，每两天更换iHHOs完全培养基，每7-10天传代。
二、iHHOs传代
1. 取出冷冻的基质胶置于4℃解冻，并提前将枪头放置在-20℃预冷1h。
2. 吸除培养基，加入1 mL预冷的PBS溶解基质胶，将混合液转移到1.5 mL EP管中，300 g离心5 min，去除上层的PBS和基质胶。
3. 加入1 mL Tryple（含1% BSA），吹打5-8次，使类器官与Tryple充分接触，接着转移到培养箱中，静置解离5min。
4. 5min后取出EP管，300g离心5min，去除上清，再加入1 mL DMEM/F12（含1% BSA），吹打孔中混合物40-50次，使类器官团彻底解离成单细胞，离心，去上清。
5. 用预冷枪头按每孔30 μL的量在离心管中加入适量的基质胶，吹打5-8次，均匀混合单细胞-基质胶，注意吹打过程中避免产生气泡。
3. 加入1 mL Tryple（含1% BSA），吹打5-8次，使类器官与Tryple充分接触，接着转移到培养箱中，静置解离5min。
6. 将提前放在培养箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30 μL胶滴， 缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中。
7. 将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固。
8. 小心沿孔壁加入700 μL恢复室温的 iHHOs完全培养基，注意不要碰到胶滴。
9. 将孔板放到培养箱中，继续培养，每两天更换iHHOs完全培养基，每7-10天传代。
三、 iHHOs冻存
1. 将程序降温盒放在-20℃中预冷1h。
2. 吸除培养基，加入1 mL预冷的PBS溶解基质胶，将混合液转移到1.5 mL EP管中，300g离心5min，去除上层的PBS和基质胶。
3. 加入1 mL Tryple（含1% BSA），吹打5-8次，使类器官与Tryple充分接触，接着转移到培养箱中，静置解离5 min。
4. 5 min后取出EP管，300 g离心5 min，去除上清。
5. 加入1 mL预冷的类器官冻存液（含10 μM Y27632），重悬细胞，并转移到冻存管中。
6. 将冻存管放到提前预冷的降温盒中，将降温盒转移到-80℃冰箱，过夜；隔天将降温盒里的冻存管转移到液氮罐中，长期保存。
