产品描述
本产品为hPSC诱导分化肾类器官试剂盒,人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到肾类器官,该类器官具类似肾的细胞组成,有肾小球、肾小管上皮细胞等。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验,对类器官具有一定了解。
实验仪器、材料
仪器:生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料:6孔细胞培养板、超低吸附6孔板、离心管(规格为15 mL 和 50 mL)、移液器(规格为 10 μL、100 μL、1000 μL)、无菌吸头(规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(规格为10mL、50mL)
试剂盒内容
试剂盒使用流程
①EB形成(2天)
1.hPSC于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
2.吸去培养基。
3.孔中加入1mL PBS(无钙镁离子)洗,吸去。
4.孔中加入1mL accutase,37℃消化5min。
5.取11mL EB形成培养基与22μL EB形成补充剂混匀获得EB形成完全培养基,于超低吸附6孔板的3个孔每孔加入2mL EB形成完全培养基。
6.当看到克隆发白发亮,轻轻拍打板侧(每侧拍两下),把细胞拍下来,再在生物安全柜中,加入1mL EB形成完全培养基终止消化,把这2mL体系吸入装有3mL EB形成完全培养基的15mL离心管离心160g 5min,吸弃上清至剩余几十微升,轻弹孔底3-4下,让细胞沉淀溶于上清,往孔板里加1mL EB形成完全培养基,轻弹3-4下,混匀即可,把这一毫升细胞悬液平均悬空加入提前准备的6孔板3个孔中,37℃、5%CO2过夜。
7.第二天(D-1)镜下观察可以看到形成大量、均一的EB,半数换液,补充50%EB形成培养基(不含补充剂),置于水平摇床培养。(注意:所用培养基均应提前在工作台放置30min以恢复室温,后面操作同理。)
②后原始条纹诱导(4天)
8.D0,解冻补充剂A,将基础培养基1与补充剂A混匀,作为后原始条纹诱导培养基。
9.吸出孔中EB形成培养基,注意不要将EB吸出。
10.每孔加入2mL 后原始条纹诱导培养基,放入37℃,5%CO2的培养箱继续培养。
11.D2每孔更换2mL后原始条纹诱导培养基,操作如9、10。
③中间中胚层诱导(3天)
12.D4,解冻补充剂B,将基础培养基2与补充剂B混匀,作为中间中胚层诱导培养基。每孔更换2mL中间中胚层诱导培养基,操作如9、10。
13.D6每孔更换2mL中间中胚层诱导培养基,操作如9、10。
④肾发生(5天)
14.D7,解冻补充剂C、D,将10mL基础培养基3与补充剂C混匀,作为肾发生培养基1。每孔更换2mL肾发生培养基1,操作如9、10,放入37℃,5%CO2的培养箱培养1小时。
15.1小时后,将30mL 基础培养基3与补充剂D混匀,作为肾发生培养基2。每孔更换2mL肾发生培养基2,操作如9、10。
16.D9、D11,每孔更换2mL肾发生培养基2,操作如9、10。
⑤肾类器官成熟(11天)
17.D12开始,每2天更换成熟培养基,每孔2mL,操作如9、10,至D23。