产品描述
本产品为hPSC诱导分化肝类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到肝类器官，该类器官由肝细胞组成囊泡状结构，成熟后的类器官具有肝干细胞和肝祖细胞的双表型特征。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：细胞培养板（规格为：6孔、12孔、24孔）、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）
实验试剂
实验内容与方法
1、hPSC分化为内胚层细胞（DE）
（1）取5.938mL基础培养基1+60μL补充剂A+2μL补充剂B配成DE分化培养基①，可同时培养6孔板的3个孔；
（2）基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合，铺板，备用。
（3）当hiPSC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基,用2mL 1x室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hiPSC，吸去PBS。
（4）加入1mL的室温hESC/iPSC Passage Solution（含10 μM Y-27632），转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中5 min，使其解离成单细胞。
（5）5 min后，吸去hESC/iPSC Passage Solution，加入等体积的hESC/iPSC 完全培养基（含10 μM Y-27632），并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞。将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（5）从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
（6）离心结束，充分去除上清，用1mL DE分化培养基①重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（7）将细胞悬液转移到包被的孔中，加入1mL DE分化培养基①，使孔中的体积达到2mL；
（8）24h后（第1天），13.86mL基础培养基1+140μL补充剂A配成DE分化培养基②，可同时培养6孔板的3个孔，吸去培养基，并加入2mL DE分化培养基②，连续培养2天。
（9）第3天换HS培养基前可取一孔进行内胚层指标检测。
2、DE诱导分化为肝特化谱系细胞(HS)
（1）第3天，将19.9mL基础培养基2与100μL补充剂C充分混合，配制成HS培养基，可同时培养6孔板的2个孔，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1x室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS，每孔加入2 mL HS培养基。
（2）将培养板放入37℃ 5%CO2培养箱中培养，每24h更换一次培养基，连续培养5天。
（3） 第8天胶埋前可取一孔进行HS指标检测。
3、HS诱导分化为3D肝类器官（以24孔板6个孔为例）
（1）第8天，将194.1mL基础培养基3+5.9mL补充剂充分混合，配制成3D肝类器官培养基，分装保存
（2）在冰上解冻基质胶，并将移液器吸头提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出HS培养基，用2mL1x室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)洗涤1次。
（4）加入含10μM Y-27632的室温EDTA并在37℃、5% CO2培养箱中孵育5 min；5 min后吸去EDTA，每孔加入1mL恢复室温的DMEM/F12（含10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
（5）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞。
（6）将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min，吸出培养基并将细胞重悬于冷基质胶中，以3000-10000个细胞/孔的密度包埋在30-50μL基质胶中，将基质胶与细胞一起置于冰上。
（7）将200μL基质胶/细胞混合物按每孔30μL接种到24孔板中。
（8）将板置于37℃、5%CO2培养箱中20-30分钟使基质胶凝固。
（9）每孔加入700μL 3D肝类器官培养基进行长期培养，每隔一天更换培养基，7-10天传代。
4、3D肝类器官传代
（1）取出冷冻的基质胶置于4℃解冻，并提前将枪头放置在-20℃预冷1h；
（2）吸除培养基，加入1mL预冷的PBS溶解基质胶，将混合液转移到1.5mL EP管中，300g离心5min，去除上层的PBS和基质胶；
（3）加入1mL Tryple express，吹打5-8次，使类器官与Tryple express充分接触，接着转移到培养箱中，静置解离5min；
（4）5min后取出EP管，300g离心5min，去除上清，再加入1ml DMEM/F12，吹打孔中混合物40-50次，使类器官团彻底解离成单细胞，离心，去上清；
（6）用预冷枪头按每孔30μL的量在离心管中加入适量的基质胶，吹打5-8次，均匀混合单细胞-基质胶，注意吹打过程中避免产生气泡；
（7）将提前放在培养箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30μL胶滴，缓慢打入混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中；
（8）将培养板放在培养箱中，20-30min，使胶滴凝固；
（9）小心沿孔壁加入700μL恢复室温的3D肝类器官培养基，注意不要碰到胶滴；
（10）将孔板放到培养箱中，继续培养，每隔1天换液一次（可周一、周三、周五换液，周五可添加至800μL，周六、周日不换液），1周左右传代一次。
（11）肝类器官成熟后可进行染色鉴定或肝祖细胞/肝干细胞检测。
