hPSC诱导分化运动神经元细胞IMN-H1试剂盒使用说明书下载
产品描述
本产品为hPSC诱导分化运动神经元细胞IMN-H1诱导分化试剂盒，可用于分化获得的运动神经元细胞能表达运动神经元的特异性标志物(如 CHAT 等)，适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对神经元培养具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供两个孔的hPSC诱导分化，最终可获得6个孔的成熟运动神经元(约1.2×107个细胞)，以及可供运动神经元祖细胞扩增一代(六孔板1孔传6孔)。
本产品分化流程图
hPSC：人多能干细胞;NPC：神经祖细胞;MNP：运动神经元前体细胞;MN：运动神经元;mMN：成熟运动神经元
产品信息
表1. 试剂盒组成信息
注：括号内容如250×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A(250×)和补充剂C (62.5×)需添加进基础培养基1使其分别稀释250倍以及62.5倍，使得补充剂终浓度为1×，配成NPC诱导培养基。
实验试剂与材料
表2. 推荐试剂&材料
实验内容与方法(以hESC H1及6孔板1个孔为例)
一、试剂准备
表3. 各阶段培养基成分
(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D、E、F，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如NPC诱导培养基组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂C，若用量为20mL，配制方法为19600μL基础培养基1+80μL补充剂A(250×)+320μL补充剂C(62.5×)。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：补充剂B、D、F使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备(详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书)
(http://www.immocell.com/xiazai/hESC(H1)%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf操作说明书)
(http://www.immocell.com/xbpyvideo/4240.html操作视频教程)
三、DAY 0-6: hESC分化为神经祖细胞(NPC)
(1) 基质胶在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备用。
(2) DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。
(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(4) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(6) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤1制备的6孔基质胶包被的板上使得最终密度为3.0 × 104个细胞/cm2，在6孔板中每孔最终体积为2 mL(含10μM Y-27632)，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
(8) DAY 0: 24h后吸去培养基，并加入2mL NPC诱导培养基(成分为：基础培养基1，1×补充剂A，1×补充剂C)。
(9) 隔天使用NPC诱导培养基换液，直到第6天。
(10) 可取第6天的细胞进行免疫荧光染色检测NPC标志物如SOX2、SOX1、Nestin。
注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过10℃将迅速凝固，导致铺板失败。
四、DAY 6-12: NPC诱导分化为运动神经元祖细胞(MNP)
(1) DAY 6： 第6天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。
(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3) 3-5min后，将DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(4) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。
(5) 离心结束，充分去除上清，将6 mL预热的MNP诱导培养基(成分为：基础培养基1，1×补充剂B，1×补充剂C)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按1:3比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
(6) DAY 7: 第7天开始隔天更换一次MNP诱导培养基，直到第12天。
(7) 可取第12天的细胞进行免疫荧光染色检测MNP标志物Olig2。
注：MNP可用常规冷冻培养基(DMEM/F12、10%胎牛血清和10% DMSO)或逸漠生物无血清细胞冻存液(推荐使用)在液氮中冷冻，解冻后可在MNP扩增培养基中再次培养，培养方法见补充部分。
五、DAY 12-18: MNP诱导分化为运动神经元(MN)
(1) DAY 12: 第12天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。
(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。
(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
(4) 将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的MN诱导培养基(成分为：基础培养基2，1×补充剂D，1×补充剂E)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到提前制备的基质胶包被的6孔板上使得密度为5.0 ×104个细胞/cm2。
(7) DAY 13: 更换为不含Y-27632的MN诱导培养基。每隔一天更换培养基，直到第18天。
(8) 第18天可检测到神经元标志物(TuJ1)， 运动神经元标志物(PHOX2B 、PRPH、ISL1、ISL2)的表达
注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。
六、DAY 18-28: MN成熟阶段
(1) DAY 18: 第18天，吸去培养基，每孔加入2mL MN成熟培养基(成分为：基础培养基2，1×补充剂E)。
(2) 隔天换液，直到第28天获得成熟MN(mMN)。
(3) mMN可用MN成熟培养基继续维持培养。
(4) 这一阶段可检测到CHAT的表达。
注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。
补充:DAY 12: MNP扩增
第12天获得的MNP可扩增至少5代，5代内可维持Olig2高表达。
扩增方法如下：
(1)DAY 12: 第12天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL1×室温PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去PBS。
(2)每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室温Accutase，将培养物置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育3-5 min。
(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。
(4)将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5)仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用1mL恢复室温的MNP扩增培养基(成分为：基础培养基1，1×补充剂C，1×补充剂F)(含10μM Y-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6)按1:6比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入2 mL细胞悬液于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h 。
(7)第2天更换不含Y-27632的MNP扩增培养基。每周可传一次代。
